第六章细菌病毒文档格式.docx
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用不同的选择性培养基→测知突变的特性。
②抗性突变型：
如抗药性或抗感染性。
例如：
青霉素（penr）抗性突变的菌落。
测定突变的方法──影印法：
黎德伯格等（LederbergJ.和LederbergE.M.,1952）设计。
LederbergJ.,1958Nobel奖获得者，发现细菌转导和接合
二、病毒：
单倍体，仅一条染色体。
病毒→蛋白质外壳+核酸。
病毒分类：
寄主：
动物、植物、细菌等；
遗传物质：
DNA或RNA。
三、细菌和病毒在遗传研究中的优越性：
1．世代周期短：
大肠杆菌（E.coli）20分钟可繁殖一代。
2．便于管理和生化分析：
个体小，一般在1µ
至几µ
之间，操作管理方便。
3．便于研究基因突变：
裸露的DNA分子（有的病毒为RNA分子），容易受环境条件的影响而发生突变；
单倍体生物，不存在显性掩盖隐性问题，隐性突变也能表现出来。
4．便于研究基因的作用：
影印培养，易检出营养缺陷型突变，有利于从生化角度来研究基因的作用。
5．便于研究基因重组：
细菌具有转化、转导和接合作用，可以进行精密的遗传分析。
6.便于研究基因结构、功能及调控机制：
细菌和病毒的遗传物质简单，易于进行基因定位、结构分析和分离，基因的表达调控也适于采用生理生化的方法进行深入研究。
7.便于进行遗传操作：
染色体结构简单，没有组蛋白和其它蛋白的结合，更宜于进行遗传工程的操作。
四、突变型筛选
要得到特定表型的突变型，主要不是依赖使用不同的诱变剂，而是依赖于采用不同的筛选方法。
1.糖发酵性突变株Lac-选择：
可Lac+将和Lac-涂布于伊红-美蓝（EMB）培养基上，Lac+可形成有金属光泽的紫色菌落，而Lac-则形成白色菌落，因此很容易识别。
2.抗性突变体选择：
把经过诱变处理的细胞直接涂布到含有某种噬菌体或抗菌素的培养基上，形成的菌落克隆就是抗性突变。
3.营养缺陷型突变的选择：
如选择氨基酸营养缺陷型，可先把经诱变剂，如X射线、紫外线或化学诱变剂等处理的细菌涂布在含有所有20种氨基酸的完全培养基上，这种培养基能使各种营养缺陷型生长，培养的目的是通过细胞分裂使突变型充分表现。
待菌落出现后，用印迹法（replica-platedmethod）把它们影印到基本培养基上鉴别出在不含任何氨基酸的培养基上不能生长的克隆，然后再把这一克隆培养到只含一种氨基酸的培养基上，从而判定该突变型需哪种氨基酸才能生长。
第二节细菌的遗传分析
一、细菌的杂交
细菌主要是无性繁殖，1946年发现不同品系大肠杆菌可以杂交，并进行基因重组，从而首次发现了大肠杆菌也有“性别”。
命名：
野生型或营养缺陷型：
按照菌株所不能合成的物质的前三个字母来命名，右上角标上“+”或“-”分别代表野生型和缺陷型（突变型）。
抗生素敏感或抗性：
取前三个字母，右上角标上s或r，代表敏感或抗性，例如，链霉素敏感的写成strs，对链霉素抗性的写成strr。
不同营养缺陷型的大肠杆菌：
A菌株：
Met-bio-thr+leu+，需加甲硫氨酸和生物素。
B菌株：
Met+bio+thr-leu-，需加苏氨酸和亮氨酸。
A菌株和B菌株营养缺陷型，不能在基本培养上生长。
A+B菌株混合培养，在完全培养基上，几小时后离心，涂布基本培养基上，长出原养型（Met+bio+thr+leu+）菌落。
这种原养型细胞如何出现？
A、B菌株分别培养在基本培养基上→一边加压和吸引使培养液充分混合→结果任何一臂的培养基上均未长出原养型细菌。
∴直接接触（接合）是原养型细胞出现的必要条件。
A、B菌株中都有链霉素敏感型（Strs）和抗链霉素突变型（Strr）。
在不含链霉素的基本培养基上将这两个菌株进行正反交，即Astrs×
Bstrr与Astrr×
Bstrs，结果都可以得到原养型菌落；
在含有链霉素的基本培养基上进行同样杂交时，只有Astrs×
Bstrr得到原养型菌落，而杂交中Astrr×
Bstrs未产生原养型菌落。
说明菌株A和菌株B在杂交中起着不同的作用，菌株A相当于雄性，是遗传物质的供体（donor），而菌株B相当于雌性，是遗传物质的受体（receptor）。
在含有链霉素的基本培养基中，Astrs×
Bstrr的杂交能得到重组原养型菌落，因为供体虽然对链霉素敏感，不能分裂，但链霉素并不影响供体的基因转移。
受体是对链霉素抗性的，所以在含有链霉素的培养基中既不影响细胞分裂，也不影响它接受外源遗传物质而发生重组，从而形成原养型菌落。
反交Astrr×
Bstrs得不到原养型，因为受体对链霉素敏感，虽然供体能转移遗传物质，但受体细胞不能分裂，所以不能形成原养型菌落。
遗传物质是单向转移的。
海斯（HayesW.,1952）证明：
接合过程是一种单向转移，A菌株遗传物质→B菌株，从供体（donor）到受体（receptor）。
二、F因子
1.概念
F因子（Ffactor或Felement）：
又称性因子（sexfactor）或致育因子（fertilityfactor），是能够独立增殖的环状DNA分子，是一种附加体。
F因子是一种封闭的环状DNA分子，相对分子质量约为3.5×
106，全长约为6×
104个bp，大约为大肠杆菌环状染色体全长的2%。
他可以以游离状态存在于细胞质中。
携带F因子的菌株称为供体菌或雄性，用F＋表示。
未携带F因子的菌株为受体菌或雌性，用F－表示。
2.F因子结构包含3个区域
（1）原点（origin）是转移的起点；
（2）致育基因（fertilitygene）使它具有感染性，其中一些基因是编码形成F纤毛（Fpilus）的蛋白质，既纤毛与F-细胞表面的受体相结合，在两个细胞间形成细胞质桥；
（3）配对区（pairingregion）与细菌染色体多处的核苷酸序列相对应，因此F因子可以分别地与染色体上这些同源序列配对，通过交换整合到染色体中，成为细菌染色体的一部分。
3.F因子的三种状态：
以大肠杆菌为例：
①没有F因子，即F－；
②一个自主状态F因子，即F＋；
③一个整合到自己染色体内的F因子，即Hfr。
4.自主状态时
F因子独立进行分裂。
三、接合（conjugation）：
1.概念：
是指原核生物的遗传物质从供体（donor）转移到受体（receptor）内的过程。
特点：
需通过细胞的直接接触。
2.F因子的传递：
带F因子的细菌较少。
具有F因子的菌株可以作为供体。
∵F因子中有形成F性伞毛（Fpilus）的基因→接合管→F＋细胞中的F因子由接合管向F－传递→F－受体变成F＋。
低频重组（lowfrequencyrecombination,Lfr）：
F+和F-之间杂交只有F因子的传递，而细菌染色体并不转移，因此尽管F因子转移频率很高，但两者染色体之间重组频率很低，因此F+品系称为～。
3.Hfr细胞的形成及染色体的转移：
F因子整合到细菌染色体上（F＋→Hfr细胞），其繁殖与细菌染色体同步进行。
此时，细菌基因的重组频率增加4倍以上，∴染色体上整合有F因子的菌株，称为Hfr菌株。
在Hfr×
F－结合时，细菌染色体由一小段单链的F因子为前导而转移到F-受体→边进入边合成。
一般仅小部分细菌染色体能够转入，接合中断→受体细胞为F－，
F因子仍留在供体内。
高频重组（highfrequencyrecombination,Hfr）：
F因子整合到细菌染色体中，与F-细胞接合后可以将供体染色体的一部分或全部传递给F-受体，当供体和受体的等位基因带有不同标记时，在它们之间就可以发生重组，重组频率可达10-2以上，故称为Hfr品系。
4、细菌接合重组的特点
在接合期间，Hfr细胞和F-细胞之间的接合管常会自发断裂，进入的Hfr染色体也随之断裂，一般说很少有整条Hfr染色体转入F-细胞的。
所以：
（1）F-细胞得到的只是F因子的一部分，F因子其余部分依赖于整条Hfr染色体的转移。
这样在Hfr×
F-杂交中选出的大多数重组子仍为F-。
（2）F-受体细胞只接受部分的供体染色体，这样的细胞就称为部分二倍体（partialdiploid）或称为半合子（merozygote）。
外基因子（exogenote）：
在部分二倍体细胞中，供体提供的部分基因组称为~。
内基因子（endogenote）：
在部分二倍体细胞中，受体提供完整的基因组，称为~。
∴受体和供体的重组就是内基因子与外基因子之间的重组，而且这种重组不同于真核生物的完整的二倍体重组。
部分二倍体：
当F＋或Hfr的细菌染色体进入F－后，在一个短时期内，F－细胞内的某些位点就会成为二倍体DNA。
部分二倍体中发生交换:
单数交换：
打开环状染色体，产生一个线性染色体，这种细胞是不能成活的。
偶数交换：
产生可遗传的重组体和片段。
①如果内外基因子只发生单交换，则环状染色体被破坏，形成的线状染色体不能复制，因而含有这种线状染色体的细胞就不能繁殖。
只有偶数次的交换才能保持细菌染色体的完整性，产生有活性的重组子。
②偶数次交换得到的重组子只有一种类型，因为相反的重组子（reciprocalrecombinant）是一个线状的片段，照例不能复制，随着细胞分裂而被丢失，所以重组后细胞所产生的菌落不再是部分二倍体，而是单倍体。
四、中断杂交
50年代，雅科（JacobF.）和沃尔曼（WollmanE.）：
中断杂交试验：
发现接合时遗传物质转移是直线进行。
其方法为：
①Hfr菌株与F-菌株混合培养。
Hfr菌株：
strsa+b+c+d+ 对链霉素敏感
F-菌株：
strra-b-c-d- 抗链霉素
②不同时间取样→搅拌器中断杂交→稀释→含链霉素完全培养基→杀死Hfr细菌→抗str细菌菌落→影印培养法：
鉴定a+b+c+d+各基因转移时间。
例题：
Hfr菌株：
苏氨酸（thr+）、亮氨酸（leu+）、抗叠氮化物（azir）、抗T1噬菌体（tonr）、半乳糖（gal+）、乳糖（lac+）。
F-菌株：
thr-、leu-、azis、tons、gal-、lac型。
在时间t=0时，让这两种细胞培养物混合进行通气培养，每隔一定时间取样，把菌液放入搅拌器内搅动以打断配对的接合管，使接合的细胞分开以中断杂交，将中断接合的细菌接种在几种不同的培养基上，测定形成了何种重组子。
中断杂交实验结果表明，在接合开始后，Hfr的不同非选择标记可与F-细胞的染色体在不同时间形成重组子。
①8分钟时：
thr+进入F-细胞；
8.5分钟时：
leu+进入F-细胞；
②9分钟时：
出现叠氮化物抗性的菌落，少数azir基因进入F-细胞；
③11分钟时：
出现抗噬菌体T1的F-细菌；
④18和25分钟时：
分别出现乳糖和半乳糖发酵基因，即lac+和galb+进入F-细胞。
①重组体中各标志基因进入F-细胞中时间不同，达到最高水平的时间也不同；
②随时间的推迟，某个基因的重组率增加；
一定程度后，重组率便不再增加。
如：
10`tonr首次出现，15`时40%、25`后80%。
∴Hfr中基因是按一定的线性顺序依次进入F-菌株的。
中断杂交技术（interruptedmatingtechnigue）：
在若干不同的选择培养基（selsctivemedia）上，分析Hfr染色体上其它非选择性标记基因进入F-细菌的顺序和所需时间（分钟），绘制出连锁图。
这种根据供体基因进入受体细胞的顺序和时间绘制连锁图的技术，称为～。
表6-2大肠杆菌Hfrthr+leu+lac+gal+azistonsstrs×
F-thr－leu－lac－gal－azirtonrstrr的结果
基因
转入时间（min）
频率
thr+
leu+
azis
他ons
lac+
gal+
8
8.5
9
11
18
25
100（选择标记）
90
70
40
不同基因所能达到的稳定转移频率不同，这表明它们与thr和leu座位之间以及它们之间的顺序和距离不同。
Hfr细菌的基因按一定的时间顺序依次地出现在F-细胞。
因为基因在染色体上，染色体从这一端开始称为原点，以线性方式进入F-细胞中。
基因离开原点越远，进入F-越迟。
离开原点较远的基因，可能在转移过程（transferprocess）停止以前，仍未转移，因而斜率较低，达到的最高值也较小。
以基因出现的时间为标准→作出E.coli的遗传连锁图。
用基因转移时间进行作图，图距单位用分钟来度量，全部染色体转移需90分钟，因此大肠杆菌整个环形遗传图为90min。
同一个Hfr菌株的转移的起始点以及转移顺序在不同实验中都是相同的，但是一个F+品系可产生许多Hfr品系，这是因为F因子在细菌染色体上有许多插入位点而且其插入取向不同而形成的。
用不同的Hfr菌株进行中断杂交实验，则他们的转移起点、基因转移顺序以及转移方向都不相同。
用一种大肠杆菌的不同Hfr菌株进行中断杂交实验，作出连锁图，其基因向F-细胞转移的顺序不同。
Hfr类型 原点 基因转移顺序
HfrH O thr pro lac pur gal his gly thi
1 O thr thi gly his gal pur lac pro
2 O pro thr thi gly his gal pur lac
3 O pur lac pro thr thi gly his gal
AB312 O thi thr pro lac gur gal his gly
转移的顺序是不是随机？
thrthigly。
每一Hfr菌株的基因顺序虽不相同，但不是随机的。
任何线性的Hfr染色体的形成都可用F因子插入环状染色体的不同地点来说明。
差异：
不同Hfr菌株转移的原点（O）和转移方向不同。
进一步说明F因子和细菌染色体都是环状。
五、重组作图（recombinationmapping）
中断杂交是根据基因转移的先后次序，以时间为单位进行基因定位的。
重组作图是根据基因间重组率进行基因定位的。
两种方法相互补充，提高基因定位的精确性。
基因距离较远中断杂交作图很有效。
基因距离较近，基因间转移时间＜2分钟时，仅用中断杂交实验进行基因定位不精确可靠，应采用传统的重组作图法。
中断杂交可为重组作图提供某些基因之间连锁关系及其前后次序的依据。
例：
根据中断杂交实验已知二个基因紧密连锁:
lac-（乳糖不发酵）
ade-（腺嘌呤缺陷型）
Hfrlac+ade+×
F-lac-ade-杂交中是lac+先进入F-受体，而ade+后进入。
Hfrlac+ade+转入受体后将会发生：
①因为供体Hfr转入片段不能独立复制，如果未进入F-受体的基因组中去，那么在以后的细胞分裂中就丢失了；
②如果已进入F-基因组中去，而且在缺乏腺嘌呤的培养基上表型为F-lac+ade+，这显然是这两个基因之外发生双交换的产物，lac-ade这两个基因之间并未发生重组；
③表型为lac+ade-，这种类型在缺乏腺嘌呤的培养基上就不能生长，所以筛选不出来，而且对测定这两个基因之间的图距也没有意义，因为可能是lac+进入，而ade+还未进入F-细胞；
④只有在缺乏腺嘌呤的完全培养基上选出lac-ade+才是真正的重组子。
因为已知ade+是在lac+之后进入F-细胞，既然ade+已进入，lac+也已先进入，所以选出重组子F-lac-ade+必然是外基因子和内基因子在这两个基因之间发生交换的结果。
F-lac-ade-在缺乏腺嘌呤的条件下是不能生长的，当然对于计算这两个基因之间的图距也没有意义。
因此lac与ade之间的图距应为：
RF（lac-ade）
用重组频率（RF）所测得的基因间距离与用中断杂交以时间（T）为单位的基因间距离基本上是一致的。
两个位点间的时间约为1分钟，两个值的比RF：
T约等于20，即它们之间的关系大约是1min等于20个图距单位。
六、F`因子与性导
F+与Hfr两种菌株可以相互转变，F因子可以插入到染色体中去，形成Hfr菌株；
又可通过规则的交换和剪切，从染色体上完整地游离下来形成F+菌株。
F因子整合过程：
可逆：
发生环出时，F因子又可重新离开染色体。
Adelberg和Burns（1959）：
F`因子（F`-factor）：
F因子偶尔在环出时不够准确，会携带出染色体上的一些基因，这种因子称为F'
因子。
F'
因子携带染色体的节段大小：
从一个标准基因到半个细菌染色体。
由于F因子在细菌染色体上插入位置不同而构成不同的Hfr品系，由此形成不同的F`因子。
它们各自携带细菌的不同基因和不同长度的DNA片段，有的F`因子携带若干个基因的一大段细菌的染色体。
F’因子使细菌带有某些突出的特点：
⑴F'
因子转移基因频率极高，如同F+因子转移频率；
⑵F'
因子自然整合率极高，并且整合在一定的座位上。
∵携带与细菌染色体一样的同源区段；
而正常F因子可在不同座位整合。
性导（sexduction或F`-duction）：
指接合时由F'
因子所携带的外源DNA整合到细菌染色体的过程。
雅科和阿代尔伯格发现：
特殊的Hfr菌株能把lac+等位基因高频率地转移到Flac-受体中。
∵①lac基因位于远端，中断杂交实验中只1/1000重组率；
②由F'
携带lac+基因进入受体后可在lac位点上形成部分二倍体F'
lac+/lac-。
F`因子转移细菌基因不同于Hfr菌株。
1.Hfrthr+leu+strs×
F-thr-leu-strr
筛选出F-:
thr+leu+strr重组子
2.F`thr+leu+strs×
筛选出F`:
thr+leu+strr重组子
杂交中把混合培养物涂布在含链霉素的基本培养基上，第一个杂交选出的菌株都是F-，因此不能将thr+leu+转入F-菌株。
第二个杂交选出的菌株都带有活性的F因子，能与其他F-菌株杂交，并能将thr+leu+转入F-菌株，而且这些菌株也具有F`因子，所以都是F+，仍具有感染能力。
产生F`因子的Hfr菌株仍保持单倍体状态，F`因子转入到受体细胞之后，由于引入了供体细胞的部分基因，从而构成了部分二倍体。
性导在遗传学分析中的作用
部分二倍体如果不发生重组
1.F`因子自主复制，可在细菌细胞中延续下去；
2.性导所形成的部分二倍体可用作不同突变型之间的互补测验→确定这两个突变型是属于同一个基因或是两个不同基因；
3.观察由性导形成的杂合的部分二倍体中某一性状的表现→确定等位基因中的显隐性关系；
4.分离出大量F`因子（每个F’因子携带有不同大肠杆菌基因）→利用不同基因在一起的并发性导的频率来作图；
部分二倍体如果发生了重组
即F`因子所携带的供体细菌染色体同受体细菌染色体之间的同源重组，如果发生了单交换，就导致F`整合形成Hfr品系，同时F`因子上所携带的基因发生重组；
如果双交换，则形成F`品系，只是F`因子的细菌基因和受体染色体的等位基因之间发生互换。
并发性导（co-sexduction）:
：
是建立遗传图的另一手段，两个位点必须密切相连才能处在同一个F'
因子上。
获得两个位点间重组率→每个片段的连锁群。
性导作图法与转导作图法相同。
三种不同的致育因子的相互关系
1.F`是带有部分细菌染色体F因子，它的性质在F和Hfr之间。
Hfr通过交换，可以形成带有部分细菌染色体的F`因子，而F`因子又可通过交换整合到细菌染色体的原来位置，回复到以前的Hfr状态。
2.F`因子连同它所带有的部分细菌染色体可一起转移到F-细胞，其转移速率近于F因子。
3.有F因子的细胞是F+细胞，没有F因子的细胞是F-细胞。
F因子由供体进入F-细胞，使受体细胞成为F+细胞，但供体细胞仍为F+，其染色体很少转移。
F因子可通过简单交换整合到细菌染色体上，形成Hfr染色体。
反过来，通过简单交换，又可从Hfr染色体产生F因子。
不同的Hfr菌株的染色体转移起始点和方向不同，这是由于F因子整合的位置和方向不同的缘故。
4.Hfr能以高频率把细菌染色体转移到F-细菌中，而F因子因位于Hfr染色体的最末端，极少进入。
F`因子和F因子很容易转移到F-细胞中，但供体染色体的转移率很低。
七、转化（transformation）
概念：
某些细菌通过其细胞膜摄取周围供体的染色体片段，将此外源DNA片段通过重组整合到自己染色体组的过程。
1928年，格里费斯（GriffithF.）在肺炎双球菌中发现转化现象。
1944年，阿委瑞（AveryO.T.）进行肺炎双球菌转化试验；
证实遗传物质是DNA；
转化是细菌交换基因的方法之一。
转化的条件：
细菌活跃摄取外源DNA分子；
具备重组程序所必需的酶。
转化三种细菌：
肺炎双球菌；
枯草杆菌；
流感嗜血杆菌。
转化的两个例子：
①用两个带有不同抗性的肺炎双球菌群体混合→可以发现带有双抗性的细菌。
细菌裂解→DNA残留→其它细菌摄取转化。
②枯草杆菌活细胞表面分泌DNA，可被其它细胞摄取。
（一）供体与受体的互作：
①转化片断的大小：
肺炎双球菌转化：
DNA片断至少有800bp；
枯草杆菌的转化：
DNA片断至少有16000bp。
②供体DNA分子存在的数目：
供体DNA分子数目与特定基因的成功转化有关。
链霉素抗性基因转化：
每个细胞含有10个DNA分子之前，抗性转化体数目一直与DNA分子存在数目成正比。
原因：
细菌的细胞壁或细胞膜上有固定数量的DNA接受座位，故一般细菌摄取的DNA分子数<
10个。
③受体的生理状态：
感受态是处于刚停止DNA合成、而蛋白质合成继续活跃进行时的状态。
活跃合成的蛋白质可使细菌细胞壁易于接受转化DNA。
只有感受态受体细胞才能摄取并转化外源DNA，而这种感受态也只能发生在细菌生长周期的某一时间范围内。
（二）转化DNA的摄取和整合过程：
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