shRNA表达载体的改建及初步应用.docx

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shRNA表达载体的改建及初步应用

shRNA表达载体的改建及初步应用*

陈娴**，谢渊　赵艳周建奖***

（贵阳医学院贵州省分子生物学重点实验室，贵州贵阳550004）

摘要目的：

通过对小发卡RNA（smallhairpinRNA,shRNA）表达载体的改建快速有效筛选重组shRNA表达载体，并可使线性化载体环化，长期保存。

方法：

制备含有单一限制性内切酶NOTⅠ识别序列的双链DNA插入片段，与BamHⅠ和HindⅢ酶切线性化的shRNA表达载体pSilencer3.1-H1连接，构建载体pSilencer3.1-H1/NOTⅠ，再用BamHⅠ和HindⅢ双酶切pSilencer3.1-H1/NOTⅠ，将含靶向目的基因的siRNA表达框的DNA模板与其连接，构建shRNA表达载体。

选择阳性克隆，提取质粒DNA，用NOTⅠ进行单酶切，选取不能被NOTⅠ切开的质粒，对其进行测序。

结果：

通过测序证实pSilencer3.1-H1/NOTⅠ和含siRNA表达框的表达载体成功构建，在pSilencer3.1-H1/NOTⅠ表达载体中不能被NOTⅠ酶切的重组质粒均为含目标shRNA的真核表达载体。

结论：

通过对shRNA表达载体的改建可以快速有效的筛选shRNA表达载体。

关键词RNA干扰小发卡RNA基因沉默表达载体

中图分类号：

Q789

当病毒感染真核细胞或当转座子和外源基因随机整合到宿主基因组时，由于病毒复制及外源转基因插入位点附近的启动子异常转录，常产生双链RNA（double-strandedRNA,dsRNA）。

dsRNA经细胞内的酶促反应迅速加工成具有特定大小和活性的小dsRNA片段，这些小的dsRNA可介导外源基因的mRNA发生特异性降解，称为小干扰RNA（smallinterferingRNA,siRNA）。

这种依赖于dsRNA的转录后基因沉默的过程称为RNA干扰（RNAinterference,RNAi）。

外源性siRNA可以通过：

①化学合成；②T7启动子下的体外转录；③dsRNAs经重组酶Dicer酶切法；④PCR制备的短发夹RNA（shorthairpinRNA,shRNA）表达框在细胞中表达，即编码目的shRNA基因的表达框在体内转录后产生内源性的siRNA[1]。

前三种合成的siRNA所介导的基因下调是瞬时的，而通过构建shRNA表达框的载体转染细胞后能发挥瞬时或稳定的基因抑制效应。

目前，用于RNAi的商业化载体主要有：

pSilencer4.1-CMV/neo，pShuttle1.0-CMV，pGenesil-1/neo等载体。

本实验所采用的pSilencer3.1-H1/neo是ambion公司生产的两端带有BamHⅠ和HindIII限制性内切酶酶切位点的线性化载体，通过其带有的RNA聚合酶Ⅲ的H1启动子，转录产生shRNA，在细胞内经Dicer的切割生成siRNA。

通常，在构建siRNA表达框的质粒载体时，插入的siRNA表达框分子量常只有几十个bp，而载体为几千个bp，在载体构建之后的初筛极为困难，也很难通过双酶切鉴定，只能通过大量测序鉴定[2-4]，成本高，时间长。

本实验通过在线性化的pSilencer载体的BamHⅠ和HindIII粘性末端插入NOTⅠ限制性内切酶酶切位点来改建shRNA表达载体，通过NOTⅠ的单酶切，可以快速有效筛选插入siRNA表达框的阳性表达载体，且通过该方法使pSilencer线性化载体能环化后长期保存，循环使用。

1.材料与方法

1.1.材料

1.1.1试剂

DNA纯化试剂盒、质粒小提试剂盒均购自天根生化科技有限公司，BamH1、HindIII、NOTⅠ限制性内切酶均购自Takara，T4DNA连接酶购自Fermentas，其它试剂均采用国产分析纯，含NOTⅠ限制性内切酶酶切位点的单链寡核苷酸由大连宝生物公司合成。

3条靶向目的基因的shRNA（shRNA1，shRNA2，shRNA3）由Ambion公司在线设计，大连宝生物公司合成。

1.1.2菌株与载体

大肠杆菌DH5α由本室保存，线形化pSilencer3.1-H1（含BamHⅠ和HindIII酶切位点）由本室齐晓岚博士馈赠，酶切后切胶纯化获得。

1.2方法

1.2.1构建pSilencer3.1-H1/NOTⅠ表达载体

使用的载体pSilencer3.1-H1是插入了目的基因后环化的载体，经BamHⅠ和HindIII双酶切、切胶纯化后获得pSilencer线性载体。

线性化pSilencer3.1-H1两端含BamHⅠ和HindIII的粘性末端，合成两条含有NOTⅠ限制性内切酶酶切位点的寡核苷酸短链，序列分别为5’-GATCCGCGGCCGCGGAAA-3’及5’-AGCTTTTCCG　CGGCCGCG-3’，2条寡核苷酸单链经退火形成双链DNA片段，两端分别是BamHⅠ和HindIII的粘性末端，用T4DNA连接酶将其与pSilencer3.1-H1线性化载体连接，转化大肠杆菌DH5α，碱裂解法提取阳性转化子质粒的ＤＮＡ，纯化后用NOTⅠ限制性内切酶酶切，琼脂糖凝胶电泳。

筛选被酶切的质粒测序鉴定，命名为pSilencer3.1-H1/NOTⅠ。

1.2.1pSilencer3.1-H1/NOTⅠ的初步应用

设计靶向目的基因的三对siRNA表达框分别退火形成dsDNA片段，两端分别是BamHⅠ和HindIII的粘性末端，同时用BamHⅠ和HindIII过夜双酶切pSilencer　3.1-H1/NOTⅠ，经琼脂糖凝胶电泳分离、纯化线性pSilencer3.1-H1/NOTⅠ，将其分别与制备好的3条dsDNA连接，转化大肠杆菌DH5α后选取多个阳性转化子扩大培养，质粒小提试剂盒提取质粒DNA，NOTⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳。

选取不能被NOTⅠ酶切的质粒测序鉴定。

2．结果

2.1pSilencer3.1-H1/NOTⅠ表达载体构建及酶切鉴定

将含有NOTⅠ酶切位点的短核苷酸链与pSilencer3.1-H1连接构建pSilencer3.1-

H1/NOTⅠ表达载体（见图1），NOTⅠ酶切位点位于BamHⅠ和HindIII之间，并能被NOTⅠ酶切（见图2）

2.2pSilencer3.1-H1/NOTⅠ表达载体测序鉴定

选取图2中被NOTⅠ酶切的载体，进行测序鉴定后比对（图3），测序结果与我们设计的含有NOTⅠ限制性内切酶酶切位点的寡核苷酸链序列一致，证实pSilencer3.1-H1/NOTⅠ表达载体构建成功。

2.3pSilencer3.1-H1/NOTⅠ的初步应用

用BamHⅠ和HindIII酶切pSilencer3.1-H1/NOTⅠ，与设计的三对siRNA表达框连接（两端分别为BamHⅠ和HindIII的粘性末端），构建带siRNA表达框的pSilencer3.1-H1表达载体，NOTⅠ酶切后琼脂糖凝胶电泳，挑选未被切开的质粒进行测序鉴定（图4中3、5、7）。

结果表明与设计的siRNA表达框序列一致（图5）。

3．讨论

自2001年RNAi现象被证实也存在于哺乳动物细胞以来，RNAi技术被广泛使用，并成为研究功能基因组学强有力的生物学工具。

使用RNA干扰技术的关键在于筛选出有效而又特异的siRNA序列，使目标基因的表达减少到50%以下。

siRNA序列的选择原则包括：

（1）从cDNA序列的开放阅读框架（ORF）的起始密码子下游50-100个核苷酸处开始选择靶区域；

（2）在mRNA序列中收索序列5’-AA（N19），G/C含量大约为50%，避免富含G的序列，因为易形成4个G的重复结构；（3）将被选择的siRNA序列进行BLAST分析，以确保基因只是单个基因；（4）合成几条siRNA双链作为特异性敲减实验的对照[5]。

此外，还需根据细胞分裂的速度和目标蛋白质的半衰期选择不同的siRNA导入策略。

构建PolⅢ启动子的siRNA表达框有两种方案：

一种是构建一个含茎环结构的siRNA表达框，即启动子-正义链-茎环序列-反义链的DNA表达框，退火后，6-11个核苷酸茎环结构把siRNA的正义链及反义链连接起来，转录后生成茎环shRNA（smallhairpinRNA,shRNA），在细胞内经过Dicer切割成双链的siRNA。

另一种构建siRNA的方法是把两个PolⅢ启动子串联在同一个质粒载体上，使它们分别表达19个碱基的siRNA正义链和反义链，在细胞内自行配对形成双链siRNA。

大多数研究表明，这两种载体表达系统转录出的siRNA都能抑制靶基因的表达，但shRNA的表达载体抑制目标基因的效果明显高于串联型的siRNA表达载体。

国内卢永清[6]及苏晓通等[7]在构建shRNA表达载体时，选择在表达框的未端插入SalI限制性内切酶酶切位点，即BamHI+Sense+Loop+Antisense+终止信号+SalI+HindⅢ，再将表达框插入pSilencer3.1-H1质粒的BamHI和HindⅢ酶切位点之间，用SalI酶切来鉴定阳性克隆。

但是该方法必须针对每一条siRNA表达框插入SalI酶切位点，并且插入的SalI酶切位点可能会影响其转录。

本实验所采用的pSilencer3.1-H1是带有BamHI和HindIII酶切位点的载体，通过纯化除去消化片段，使载体不再自身环化，连接之后增加shRNA插入率。

缺点是线性载体不能重复使用，并且筛选阳性克隆极为因难，通过本实验所构建的pSilencer3.1-H1/NOTⅠ的表达载体，使其环化后长期保存，更重要的是插入siRNA表达框后利于阳性克隆的筛选，并且我们选用识别序列达8个碱基的限制性核酸内切酶NOTⅠ，减少其在质粒中随机切割概率。

随后，本研究针对目的基因设计了3条siRNA表达框，用BamHI和HindⅢ酶切pSilencer3.1-H1/NOTⅠ载体，构建了三个pSilencer3.1-H1/siRNA表达框的表达载体，阳性克隆用NOTⅠ酶切，不能被NOTⅠ酶切的质粒即为含有siRNA表达框的重组质粒，并被测序证实，本方法快速、有效。

在构建载体中要注意以下情况：

1.在酶切回收线形化质粒的过程中存在酶切不全或者未被酶切的质粒，使回收载体与外源基因连接构建表达载体的过程中，非重组背景高，克隆成功率低。

通过使用过夜酶切的方法，使得酶切充分，回收的线形质粒较纯；将质粒与外源基因的摩尔比控制在1：

10左右，将大大提高重组率。

2.应特别注意的是，NOTⅠ酶不易使质粒DNA线形化，但我们使用20μl体系过夜酶切后，经1%的琼脂糖凝胶电泳（100V,3h）鉴定，取得了很好的结果。

3.溴化乙锭能够减慢线形DNA分子的迁移率，因此，为了很好的分辨线性化质粒与环状质粒，建议在电泳过后再用EB染色。

4.用碱裂解法提取的质粒DNA纯度差，往往酶切两小时后便出现酶切过度的现象，故用DNA纯化试剂盒将碱裂解法提取后的质粒DNA进行纯化，电泳图谱（图2，4）见清晰的酶切条带。

5.转化时应进行以下对照：

（1）.环状载体作为阳性对照，判断转化体系是否有效；

（2）.pSilencer3.1-H1线性空载体，判断载体酶切是否完全，若酶切不完全，残余的环状载体在转化时可出现假阳性克隆；（3）T4DNA连接酶作用过的pSilencer3.1-H1空载体，判断载体自连的情况。

6.感受态细胞的制备时：

对空白DH5α进行增菌不宜超过4h，否则会影响其转化效率；将所用的实验仪器预冷，可以提高感受态细胞的转化效率。

7.转化子培养的时间不宜超过16h，否则阳性转化子容易丢失。

4．展望

与化学法和体外转录法诱导RNAi相比，用表达载体携带的shRNA表达框能稳定整合到细胞的基因组中，所以能在细