B细胞激活因子原核表达载体构建与纯化分子生物学论文生物学论文.docx

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B细胞激活因子原核表达载体构建与纯化分子生物学论文生物学论文

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　　B细胞激活因子（Bcellactivatingfactor,BAFF;又称TNFSF13B,THANK,CD257,BLyS或TALL1）是1999年发现的肿瘤坏死因子家族中的一员，是与人体免疫有关的细胞因子[1-3].BAFF由285个氨基酸组成，其中1~46位氨基酸为胞内区，47~73位氨基酸为疏水的跨膜区，74~285位氨基酸为胞外区。

BAFF位于细胞内的N端缺少信号肽，C端在胞外，属于Ⅱ型跨膜蛋白[1-2.BAFF主要表达在先天免疫细胞如单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞及滤泡树突细胞等。

目前已知BAFF可与3种受体相互作用，分别是B细胞成熟抗原（Bcellmaturationantigen,BCMA）[4-5]跨膜激活物与亲环素配体相互作用因子（transmembraneactivatorandCAMLinteractor,TACI）[6]及BAFF受体（BAFFreceptor3,BAFF-R,也叫BR3）[7].其中，BR3是BAFF的特异性受体，而TACI和BCMA同样也是TNF超家族的另一成员APRIL的受体。

BR3是唯一可被可溶性sBAFF三聚体激活的受体。

同许多TNF家族成员一样，sBAFF多以三聚体型式存在，与其受体相互作用，实现其生物学功能[8].在中性或碱性条件下，20个三聚体型式的sBAFF可通过其Flap区相互结合，形成类似病毒颗粒的60聚体型式，并可在酸性条件下发生不可逆的分离[9-10].BAFF的Flap环为其特有，其他TNF家族蛋白没有此结构。

三聚体形式的配体与其受体结合并不一定会激活下游信号通路，尤其是对于TACI,只有60聚体形式的BAFF才能激活它介导的生物学效应[11].

　　研究发现，BAFF的异常表达与自身免疫性疾病密切相关。

　　BAFF表达量的高低影响到B细胞的存活信号通路及产生自身抗体的B细胞的选择性凋亡[12].普遍认为BAFF过表达与系统性红斑狼疮（systemiclupuserythematosus,SLE）、类风湿性关节炎（rheumatoidarthritis,RA）、干燥综合征（Sjgrenssyndrom,SS）等多种自身免疫性疾病的发生和发展有着密切关系[13-14].因此BAFF及其受体有望成为治疗相关性疾病的新靶点。

BAFF可溶性形式为其发挥功能的主要区域，故本研究旨在对BAFF胞外区可溶性片段134~285位氨基酸残基进行克隆，构建原核表达载体。

通过IPTG导蛋白表达，经纯化及复性得到目的蛋白，为体外研究sBAFF的结构与功能关系以及进一步探讨其生物学功能奠定基础，并为以BAFF与其受体为靶点的药物设计提供新思路。

　　1材料与方法

　　1.1实验材料

　　1.1.1菌种和质粒：

质粒pET21a;大肠杆菌E.coliTop10,E.coliBL21（DE3）均由本实验室保存。

　　1.1.2试剂及耗材：

DNA限制性内切酶NdeI、XhoI,T4DNA连接酶、DNAMarker购自Takara公司；KODDNAPolymerase购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自申能生物工程公司；蛋白胨、酵母浸膏购自Sigma公司；IPTG购自Sunshine公司；丙烯酰胺和双甲叉丙烯酰胺、TEMED购Bio-Rad公司；Ni2+-NTAagarose购自Qiagen公司；透析袋购自南京晚晴公司（MW8-10kDa）;相关引物由南京金斯瑞生物技术公司合成。

　　1.1.3实验仪器：

高速离心机（CR22E,日本HITACHI公司）,超声波细胞破碎仪（SCIENTZ-IID,宁波新芝生物科技股份有限公司）,恒流泵（BT-100,上海沪西分析仪器厂有限公司）,蛋白质紫外检测仪（HD-7,南京普阳科学仪器研究所）,蛋白凝胶电泳仪（美国Bio-Rad）.

　　1.2实验方法

　　1.2.1sBAFF基因的扩增：

根据GenBank中编码人sBAFF的cDNA序列，设计一对特异性引物，扩增编码134~285位氨基酸序列，上游引物F为：

5-GGAATTCCATATGGTTCAGGGTCCAG-3,下游引物R为：

5-CGGCTCGAGCAGCAGTTTCAATG-3.其中F和R分别含有酶切位点NdeI和XhoI（下划线标出）,引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

以K562细胞的cDNA为模板，PCR扩增sBAFF基因，反应条件为：

95℃预变性5min;98℃10s,60℃15s,72℃45s,共30个循环；最后72℃10min.PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　1.2.2重组表达载体pET21a-sBAFF的构建及鉴定：

对PCR得到的片段及载体pET21a分别用限制性内切酶NdeI、XhoI进行双酶切，利用T4DNA连接酶将sBAFF酶切产物连接到pET21a载体上，并将连接产物转化到DH5感受态细胞中，涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上过夜培养。

挑取单克隆，进行菌落PCR和双酶切鉴定，鉴定为阳性者提取重组质粒，由南京金斯瑞生物技术公司测序。

　　1.2.3目的蛋白的表达及条件优化：

将测序正确的重组质粒pET21a-sBAFF转化进大肠杆菌BL21（DE3）中进行导表达。

　　将重组菌接种于含50g/mL氨苄霉素的3mLLB培养基中，37℃,220r/min培养活化过夜。

次日按1∶100接种于50g/mL氨苄霉素的3mLLB培养基中，37℃、220r/min培养至菌体OD600约为0.6,加入IPTG至终浓度1mM,分别在37℃下导表达5h和20℃下导表达16h.导结束后取菌液3mL,离心去除培养基，PBS洗涤2次后用适量PBS重悬。

菌液经超声破碎后（超声功率400W,超声2s,间歇2s,总时间1min）,12000r/min离心5min,分离上清液和沉淀，沉淀用等量PBS重悬。

分别取菌液、上清液、沉淀制样，进行SDS-PAGE凝胶电泳，分析目标蛋白的表达量和可溶性情况。

　　1.2.4Ni2+-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白：

确定了目的蛋白适宜的导温度和导时间后，分别将含有重组质粒pET21a-sBAFF的表达菌在500mLLB培养基中扩增培养并导表达。

离心收集菌体，PBS洗涤2次后用40mLPBS重悬，冰浴超声破碎直至菌液呈半透明，于4℃，12000r/min离心15min,收集包涵体沉淀。

向沉淀包涵体加入4mL含有8mol/L尿素和10mmol/LPMSF的PBS,于冰上搅拌溶解，4℃,12000r/min离心15min,留取上清。

首先将Ni2+-NTA亲和层析柱用BindingBuffer（含有8mol/L尿素的PBS）平衡。

以0.2mL/min的流速缓慢上样，使蛋白能够与柱子充分结合。

用BindingBuffer平衡柱子5个柱体积后，用WashingBuffer（含有8mol/L尿素，50mmol/L咪唑的PBS）洗脱杂蛋白。

用含有不同浓度咪唑的ElutionBuffer（含有8mol/L尿素，200/500mmol/L咪唑的PBS）洗脱目的蛋白。

收集各组分的洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳，分析目的蛋白的洗脱情况。

　　1.2.5蛋白的透析复性：

将透析袋于含2%NaHCO3和1mmol/EDTA的溶液中煮10min,用ddH2O冲洗干净，再于1mmol/LEDTA的溶液中煮10min,用ddH2O冲洗干净。

将含有纯度较高的目的蛋白的洗脱缓冲液装入预处理的透析袋中。

　　复性缓冲液由含不同浓度的尿素（6、4、2、1、0mol/L）和0.1mmol/LPMSF的PBS组成。

目的蛋白在4℃经上述尿素浓度不断降低的复性缓冲液中搅拌透析，每次8h,使变性的目的蛋白在此过程中自然复性，从而得到有活性的目的蛋白。

透析结束后，经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定其复性效果。

　　2结果

　　2.1sBAFF基因扩增产物的鉴定以K562细胞的cDNA为模板，设计含有特定酶切位点的特异性引物，对BAFF的134~285位氨基酸进行扩增，预期扩增产物sBAFF大小分别约为468bp.PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳后，可见条带清晰单一，片段大小与预期结果一致，结果见图1.

　　2.2重组表达质粒的鉴定经抗生素筛选和菌落PCR鉴定得到阳性重组子pET21a-sBAFF.质粒载体中含有T7启动子序列，采用T7引物进行测序。

测序结果采用BLAST程序进行比对分析，确定与预期相符，成功将Flap区进行了有效突变。

　　2.3目的蛋白的表达及条件优化将构建成功的重组原核表达质粒pET21a-sBAFF转化大肠杆菌BL21（DE3）后，在1mmol/LIPTG浓度下，分别在37℃下导表达5h和20℃下导表达16h.经SDS-PAGE分析表明，目的蛋白在2种不同导条件下都得到了有效表达，相对分子量约为18000,在菌体内主要以包涵体形式存在，见图2和图3.进一步灰度扫描显示，在37℃导5h下，目的蛋白sBAFF的表达量占菌体总蛋白的32.16%,其中可溶的sBAFF占菌体上清总蛋白的19.02%.而低温20℃导16h下，目的蛋白的表达量有所提高，sBAFF的表达量占菌体总蛋白的38.59%,其中可溶的sBAFF占菌体上清总蛋白的30.89%.说明20℃低温导不仅有利于增加目的蛋白的可溶性表达，而且有利于增加目的蛋白的总表达量。

　　2.4目的蛋白的纯化目的蛋白主要以包涵体的形式存在，分离包涵体沉淀后在变性条件进行蛋白纯化。

包涵体溶解物经Ni2+-NTA亲和层析柱纯化，得到纯度较高的目的蛋白。

对不同咪唑浓度的洗脱收集液进行SDS-PAGE凝胶电泳，结果显示sBAFF在200mmol/L咪唑洗脱下蛋白纯度较高，达到86.48%,见图4.因而收集纯度较高的目的蛋白进行后续的复性。

　　2.5目的蛋白的复性对收集的目的蛋白采取逐步降低尿素浓度的方法进行透析，除去蛋白溶液中的尿素，使变性的目的蛋白缓慢地进行自然复性。

复性后的目的蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分析，结果显示除了18kD