备战高考生物一轮复习第40讲 基因工程 讲义Word文件下载.docx
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大肠杆菌
T4噬菌体
特点
只缝合黏性末端
缝合黏性末端和
末端
作用
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
3.载体
(1)作用:
携带外源DNA片段进入受体细胞。
(2)种类:
质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
(3)条件
[基础自测]
1.判断下列叙述的正误
(1)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列(×
)
(2)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因(×
(3)限制酶只能用于切割目的基因(×
(4)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来(×
(5)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶(×
(6)E·
coliDNA连接酶既可连接平末端,又可连接黏性末端(×
(7)用于载体的质粒DNA分子上至少含一个限制酶识别位点(√)
(8)载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中,使之稳定存在并表达(√)
2.载体需具备的条件及其作用(连线)
3.据两种限制酶的作用图示填空
(1)已知限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG,在图中画出两种限制酶切割DNA后产生的末端。
(2)写出产生的末端的种类:
①产生的是黏性末端;
②产生的是平末端。
(3)EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列不同,切割位点不同(填“相同”或“不同”),说明限制酶具有专一性。
4.学透教材、理清原因、规范答题用语专练
(1)①是________酶,②是____________酶,二者的作用部位都是______________。
(2)限制酶不切割自身DNA的原因:
__________________________________________。
答案:
(1)限制 DNA连接 磷酸二酯键
(2)自身DNA不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰
1.与DNA有关的酶的比较
名称
作用部位
作用底物
作用结果
限制酶
磷酸二酯键
DNA
将DNA切成两个片段
DNA连接酶
DNA片段
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶或热稳定DNA聚合酶
脱氧核苷酸
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水解)酶
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶
碱基对之间的氢键
将双链DNA分子局部解旋为单链,形成两条长链
RNA聚合酶
核糖核苷酸
将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端
2.限制酶的特点与使用
(1)限制酶具有特异性,即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列,并在特定的位点上进行切割;
限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶,以获得相同的黏性末端。
但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同,在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。
(3)为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“环化”,可用不同的限制酶分别处理含目的基因的DNA和载体,使目的基因两侧及载体上各自具有两个不同的黏性末端。
[对点落实]
1.(2016·
全国卷Ⅲ)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点,图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
↓ ↓ ↓
——GAATTC—— ——GGATCC—— ——GATC——
——CTTAAG—— ——CCTAGG—— ——CTAG——
↑ ↑ ↑
图(a)
根据基因工程的有关知识,回答下列问题:
(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接,理由是____________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子,如图(c)所示。
这三种重组子中,不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________,不能表达的原因是_______________________________________________________________________
图(b) 图(c)
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶,常见的有________________和________________,其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是______________。
解析:
(1)由题图可知,BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制性内切酶的共同识别序列是
,二者切割可以形成相同的黏性末端,因此经BamHⅠ酶切得到的目的基因可以与图(b)所示表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。
(2)在基因表达载体中,启动子应位于目的基因的首端,终止子应位于目的基因的尾端,这样目的基因才能顺利地转录,再完成翻译过程,即顺利表达。
图中甲所示的目的基因插入在启动子的上游,丙所示目的基因插入在终止子的下游,二者的目的基因均不能被转录,因此目的基因不能表达。
(3)常见的DNA连接酶有E·
coliDNA连接酶和T4DNA连接酶,其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。
(1)Sau3AⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端
(2)甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游,丙中目的基因插入在终止子的下游,二者的目的基因均不能被转录(其他合理答案也可) (3)E·
coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶(其他合理答案也可)
2.(2016·
江苏高考,有改动)下表是几种限制酶识别序列及其切割位点,图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点,其中切割位点相同的酶不重复标注。
请回答下列问题:
BamHⅠ
BclⅠ
Sau3AⅠ
HindⅢ
识别序
列及切
割位点
(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒,应选用__________________两种限制酶切割,酶切后的载体和目的基因片段,通过________酶作用后获得重组质粒。
为了扩增重组质粒,需将其转入处于________态的大肠杆菌。
(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌,应在筛选平板培养基中添加________,平板上长出的菌落,常用PCR鉴定,所用的引物组成为图2中________________________________________________________________________。
(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接,连接部位的6个碱基对序列为________________________,对于该部位,这两种酶________(填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。
(4)若用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得________种大小不同的DNA片段。
(1)基因工程中选择合适的限制酶切割质粒和目的基因时,应保留目的基因和至少一个标记基因结构的完整性,即遵循“目的基因切两侧,标记基因留一个”的基本原则,最好选择切割产生不同末端的两种限制酶同时切割质粒和目的基因,以避免目的基因的反向插入带来的不正常表达,因此据图分析应选择的限制酶为BclⅠ和HindⅢ,切割后质粒上保留的四环素抗性基因作为标记基因。
酶切后的载体和目的基因通过DNA连接酶的作用形成重组质粒,重组质粒需要导入Ca2+处理后的处于感受态的大肠杆菌(处于感受态的大肠杆菌细胞膜的通透性大大增加,便于重组质粒进入)。
(2)由上述分析可知,为了筛选出导入重组质粒的大肠杆菌,应先配制含四环素的选择培养基,平板上长出的菌落为导入普通质粒或重组质粒的大肠杆菌菌落,进一步鉴定出导入重组质粒的大肠杆菌,可利用PCR扩增的方式,结合电泳技术来分析处理。
DNA的两条链是反向平行的,在PCR过程中,当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后,DNA聚合酶只能从引物的3′端延伸DNA链,因此应选择引物甲和引物丙。
(3)因为BclⅠ和BamHⅠ酶切产生的黏性末端相同,所以可以被DNA连接酶连接,连接部位的6个碱基对序列为
,但是连接后形成的DNA中不再具有BclⅠ和BamHⅠ的识别序列,连接部位不能被这两种酶切开。
(4)由图可知,能被限制酶BclⅠ和BamHⅠ切割的序列也能被Sau3AⅠ识别并切割,因此图中质粒上存在3个Sau3AⅠ的切割位点,若将3个切割位点之间的DNA片段分别编号为a、b和c,则完全酶切(3个切割位点均被切割)会产生3种大小的DNA片段,即为a、b和c;
考虑只切1个切割位点,有3种情况,都产生1种大小的DNA片段,即大小均为a+b+c;
考虑切2个切割位点,则会产生a+b、c、a+c、b、b+c、a几种不同大小的DNA片段。
综上所述,若用Sau3AⅠ识别并切割图中质粒,最多可获得7种大小的DNA片段,即为a+b+c、a+b、a+c、b+c、a、b、c。
(1)BclⅠ和HindⅢ 连接 感受
(2)四环素 引物甲和引物丙 (3)
都不能 (4)7
[类题通法]
选择限制酶的技巧
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致,以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等,所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构,如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因。
考点二 基因工程的基本操作程序
基因工程的基本操作程序
―→
1.目的基因的获取
(1)目的基因:
主要是指编码蛋白质的基因,也可以是具有调控作用的因子。
(2)获取方法
2.基因表达载体的构建
(1)构建基因表达载体的目的
①使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代。
②使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成:
目的基因、启动子、终止子及标记基因等。
3.目的基因导入受体细胞
受体细胞类型
方法
植物细胞
农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法
动物细胞
显微注射技术(注射到受精卵内)
微生物细胞
感受态细胞法(Ca2+处理法)
4.目的基因的检测与鉴定
检测目的