设计性实验项目申请书终稿文档格式.docx

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（一）研究目的

1.明确骨碎补的有效成分

2.分析确定骨碎补作用于组织细胞的最佳浓度配比等

3.从分子水平解释骨碎补在骨伤愈合中队骨痂组织的作用机理

（二）国内外研究现状分析

骨碎补是一味骨伤科常用的中药，为水龙骨科多年生附生蕨类植物槲蕨的根茎。

传统中医认为骨碎补性味苦温归肾肝经,具有补肾强骨、续伤镇痛功效,用于肾虚腰痛、耳鸣耳聋、牙齿松动、跌打闪挫、筋骨折伤;

外治斑秃、白癜风等症。

最新研究发现骨碎补的提取部位对UMR106成骨样细胞的增殖有促进作用，但是骨碎补对破骨细胞性骨吸收的作用目前尚不明确，从分子水平也暂时无法清晰地解释其作用机理。

（三）研究意义

1.加深对骨碎补功效的了解，便于对其更好的保护和开发

2.利于药物新剂型研究工作，具有进一步研发成抗骨质疏松或骨质吸收新药的前景

3.助于中医药，中草药的研究发展

（四）主要参考文献

［1］NIHconsensusdevelopmentpanelonosteoporosisprevention，diagnosisandtherapy．Osteoporosisprevention，diagnosisandtherapy［J］．JAMA，2001，285（6）:

785-795．

［2］王华松,黄琼霞,许申明.骨碎补对骨折愈合中血生化指标及TGF-1表达的影响[J].中医正骨,2001,13（5）:

6-8.

［3］陈航，高燕，王茹欣，等．阿仑膦酸盐治疗慢性肾脏病患者糖皮质激素性骨质疏松的临床观察［J］．中国医药，2007，2（11）:

646-647．

［4］刘振丽，吕爱平，张秋海，等．骨碎补脂溶性成分的研究［J］．中国中药杂志，1999，24（4）:

222-223，225．

［5］姬洪全,党耕町,马庆军,等骨折愈过程中转化生长因子Β1的基因表达中华骨科杂志1988，18（9）：

544

［6］BorgesJL，BilezikianJP．Updateonosteoporosistherapy［J］．ArqBrasEndocrinolMetabol，2006，50（4）:

755-763．

7］BoonenS，RizzoliR，MeunierPJ，eta1．TheneedforclinicalguidanceintheuseofcalciumandvitaminDinthemanage-mentofosteoporosis:

aconsensusreport［J］．OsteoporosisInt，2004，15（7）:

5l1-519．

[8]常德友，董福慧．骨碎补的研究概况［J］．吉林中医药，2006，26（6）:

61-62．

二、项目研究内容（主要研究内容、拟解决的关键问题、创新点等）

（一）项目主要研究内容

一．研究骨碎补的化学成分方法

1.采用硅胶柱色谱、SephadexLH-20柱色谱、中低压ODS柱色谱及制备液相等方法进行分离纯化，并根据化合物的理化性质及波谱数据对结构进行鉴定

2.提取与分离

骨碎补干燥药材约3.0kg，60%（体积分数）乙醇回流提取3次，每次2h，合并滤液，减压浓缩至无醇味，加入适量水混悬后，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。

乙酸乙酯层浸膏24.0g，经减压硅胶柱色谱，氯仿-甲醇（100∶0→1∶1）溶剂系统梯度洗脱，TLC检测合并，得到7个流分（Fr.1～Fr.7）。

Fr.2经ODS中低压柱色谱，再经制备液相得到化合物5（21.0mg）。

Fr.3经SephadexLH-20凝胶柱色谱氯仿-甲醇（体积比1∶1）等度洗脱，ODS中低压柱色谱，再经制备液相得到化合物8（8.5mg）和化合物6（56.0mg）。

Fr.4经SephadexLH-20凝胶柱色谱甲醇-水（体积比1∶1）等度洗脱，ODS中低压柱色谱，再经制备液相得到化合物7（8.5mg）和化合物2（5.0mg）。

Fr.5经ODS中低压柱色谱，SephadexLH-20凝胶柱色谱甲醇-水（体积比1∶1）等度洗脱，再经制备液相得到化合物1（10.5mg）。

Fr.6经ODS中低压柱色谱，SephadexLH-20凝胶柱色谱甲醇-水（体积比1∶1）等度洗脱，再经RP-HPLC得到化合物3（8.0mg）和化合物4（6.8mg）。

Fr.7经重结晶（水）得到化合物9（50.6mg）

3.结构鉴定

分析数据，参比文献，推断化合物分子式

二．探究骨碎补对破骨细胞骨吸收的影响

1.薄骨片制作处理　

取新鲜的牛胫骨放入低温冰箱储存,用钢齿锯将其切成薄片,再磨成10Λmg片厚的骨磨片,在蒸馏水中超声清洗10min×

3次,置于双抗液中（青霉素100Λgml,链霉素100Λgml）-30℃冻存待用。

使用时先将其解冻,70%酒精浸泡30min,超净台中紫外线照1h,取出加入含MEM的24孔培养板中,每孔5块4mm×

4mm骨片,37℃孵育1h,备用。

2.药物血清的制备　

选用普通级SD大鼠20只,随机分为A、B二组。

二组大鼠自由进行饲养,分别用中药骨碎补提取液和蒸馏水灌胃大鼠,每次2mlg200g,每天给药两次,连续给药3天,末次给药后1小时采血。

每只大鼠采血约4～6ml,分别装入20只无菌离心管内离心。

离心后用长头吸管吸取上清,同组血清混合匀装入无菌瓶内,放入36℃的水浴箱30min灭活,放入-20℃的冰箱内保存备用。

3.破骨细胞的分离与培养　

采用Fenton2等人的方法加以改良,选用出生一月龄SD雄性大鼠2只,拉颈处死,放入75%的酒精浸泡15分钟。

无菌条件下分离出四肢长骨骨干,剔除骨干周围的软组织,剪断骨干两端骨骺,在装有纯MEM的培养液的培养皿中清洗骨干并转移到另外一个盛有纯MEM的培养液的培养皿中,用注射器抽取纯MEM反复冲洗骨髓腔,冲洗不少于3次,将得到有细胞的悬液用200目的筛网过滤两遍后,放入无菌离心管内离心（1000rpm,10min）。

去上清后,用含有MEM培养液稀释离心后沉淀的细胞,并在显微镜下计数,调至细胞数为1×

106gml后,继续孵育3。

3.骨吸收陷窝的测定　

将细胞悬液放入盛有牛骨片的24孔培养板中,每孔含5片骨片,倒置显微镜观察见有大量的细胞后,放入体积分数为37°

C,5%CO2的培养箱中,24小时后更换培养液,洗去未贴壁的细胞,更换培养液:

第一组加含20%中药骨碎补药物血清的培养液;

第二组加含10%中药骨碎补药物血清的培养液;

第三组加含空白血清的培养液。

每24小时换液1ml。

6天后,取出骨片,以体积分数为2.5%戊二醛固定30min,以质量分数为0.1%甲苯胺蓝硼酸盐溶液染色2min。

然后分别置入0.25molgL的氨水中,超声振荡2min以上,用上述染液复染5min4,丙酮脱水。

LeicaQuantimet500图像分析仪检测骨吸收陷窝面积和记录骨吸收陷窝数目。

4.数据处理

三．研究骨碎补在动物骨伤愈合中对骨痂组织的作用效果

1.将60只雄性小鼠随机分成三组:

生理盐水组（A）、骨碎补组（B）、伤科接骨片组（C）。

按标准骨折模型方法造模,不作任何外固定,分笼饲养。

从手术后第二天开始灌胃给药,骨碎补组每天以骨碎补水煎液分早晚2次灌胃,伤科接骨片组每天给药2次,对照组同时给予等量生理盐水。

于术后第7天、14天、21天每组分别处死动物4只,取出骨标本。

骨标本制成切片测量骨痂厚度及TGF2Β1免疫组化染色。

2.骨标本的制备及检测项目　

动物处死后,以实验骨折处为中心,取长度约1cm的胫骨骨干,置于4%的多聚甲醛溶液中,4℃下固定48小时,再于15%的EDTA溶液中脱钙14天,1周时更换脱钙液。

取材,经梯度酒精逐级脱水后浸蜡,石蜡纵向包埋、切片,厚度为5Λm,部分切片进行HE染色并作组织学观察及骨痂厚度测量,部分切片进行TGF2Β1免疫组化染色。

3.骨痂厚度测量　

在100倍镜下,每张切片以骨折为中心选取10个视野,用目镜测微尺测量骨痂厚度并计算平均值。

2.2.2　TGF2Β1免疫组化染色　切片脱蜡至水,置于新鲜配制的3%H202溶液中,室温下10分钟以灭活内源性过氧化酶,滴加复合消化液5～10分钟,再滴加5%山羊血清封闭液,置入生物医学实验仪,用第2档辐射30秒。

滴加1∶100稀释的兔抗鼠TGF2Β1抗体,第3档辐射50秒,复温后用0.01MPBS溶液冲洗。

滴加1∶200生物素化羊抗兔抗体,第3档辐射50秒,用0.01MPBS溶液冲洗。

滴加试剂SABC,第3档辐射45秒,用0.01MPBS溶液冲洗。

DAB显色,复染,脱水,透明,封片,显微镜观察。

（二）拟解决的关键问题

1.分析并对骨碎补化学组成中有效成分进行分离提纯

2.找到骨碎补的最佳作用浓度

3比对白兔在骨伤愈合中骨碎补对骨痂组织的作用效果

4.分析总结总结骨碎补在分子水平的作用机理

（3）创新点

1.采取化学分析并提纯中草药骨碎补的有效成分

2.确定了骨碎补的最佳作用浓度

3.从分子水平研究骨碎补对骨伤组织愈合的作用机理

三、项目实施方案（研究思路、技术路线、研究方法等）

（一）研究思路

1.分析骨碎补的化学组成，生物活性成分。

2.采用破骨成骨细胞共培养体添加不同浓度的骨碎补提取物,发现骨碎补提取物对骨细胞作用的最佳浓度，骨碎补组不同基因不同的作用时间点与强度。

3.运用活体动物实验，检测骨标本制成切片测量骨痂厚度及TGF2Β1的含量，分析骨碎补在骨痂组织中的作用机制。

（二）技术路线

1.对骨碎补化学成分的提纯鉴定

采用硅胶柱色谱、SephadexLH-20柱色谱、中低压ODS柱色谱及制备液相等方法进行分离纯化，并根据化合物的理化性质及波谱数据对结构进行鉴定。

2.体外分离出破骨细胞,与牛骨磨片共同培养,通过Leica图像分析仪观察破骨细胞所形成骨吸收陷窝的数目与面积,反映破骨细胞性骨吸收情况。

结果用SPSS软件包分析

3.探究骨碎补的作用机理

采用活体动物实验，标本制备和各项指标测定

（三）研究方法

1.通过化学分析得到骨碎补的有效成分

2.体外分离