设计性实验项目申请书终稿文档格式.docx

1、（一）研究目的1.明确骨碎补的有效成分2.分析确定骨碎补作用于组织细胞的最佳浓度配比等3.从分子水平解释骨碎补在骨伤愈合中队骨痂组织的作用机理（二）国内外研究现状分析 骨碎补是一味骨伤科常用的中药，为水龙骨科多年生附生蕨类植物 槲蕨的根茎。传统中医认为骨碎 补性味苦温归肾肝经, 具有补肾强骨、续伤镇痛功效, 用于肾虚 腰痛、耳鸣耳聋、牙齿松动、跌打闪挫、筋骨折伤; 外治斑秃、白 癜风等症。最新研究发现骨碎补的提 取部位对UM R106 成骨样细胞的增殖有促进作用，但是骨碎补对破骨细胞性骨吸收的作用目 前尚不明确，从分子水平也暂时无法清晰地解释其作用机理。（三）研究意义1.加深对骨碎补功效的了解

2、，便于对其更好的保护和开发2.利于药物新剂型研究工作， 具有进一步研发成抗骨质疏松或骨 质吸收新药的前景3.助于中医药，中草药的研究发展（四）主要参考文献1 NIH consensus development panel on osteoporosis prevention， diagnosis and therapy Osteoporosis prevention，diagnosis and therapy J JAMA，2001，285（ 6） :785-795 2王华松, 黄琼霞, 许申明. 骨碎补对骨折愈合中血生化指标及 TGF-1表达的影响 J. 中医正骨, 2001, 13（ 5）

3、: 6- 8. 3 陈航，高燕，王茹欣，等 阿仑膦酸盐治疗慢性肾脏病患者糖 皮质激素性骨质疏松的临床观察J 中国医药，2007， 2 （ 11） :646-6474 刘振丽，吕爱平，张秋海，等 骨碎补脂溶性成分的研究J 中国中药杂志，1999， 24（ 4） :222-223，2255 姬洪全, 党耕町, 马庆军, 等骨折愈过程中转化生长因子 1 的基因表达 中华骨科杂志 1988，18（9）：5446 Borges JL，Bilezikian JP Update on osteoporosis therapyJ Arq Bras Endocrinol Metabol，2006， 50（ 4）

4、 :755-763 7 Boonen S，Rizzoli R，Meunier PJ， et a1 The need for clinical guidance in the use of calcium and vitamin D in the manage- ment of osteoporosis: a consensus reportJ Osteoporosis Int， 2004， 15（ 7） :5l1-519 8 常德友，董福慧 骨碎补的研究概况 J 吉林中医药，2006， 26（ 6） :61-62二、项目研究内容（主要研究内容、拟解决的关键问题、创新点等）（一）项目主要研究内容

5、一研究骨碎补的化学成分方法 1.采用硅胶柱色谱、SephadexLH-20 柱色 谱、中低压 ODS 柱色谱及制备液相等方法进行分离纯化，并根据化合物的理化性质及波谱数据对结构进行鉴定2.提取与分离 骨碎补干燥药材约 3. 0 kg，60% （ 体积分数） 乙醇回流提取 3 次，每次 2 h，合并滤液，减压浓缩 至无醇味，加入适量水混悬后，依次用等体积的石 油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。乙酸乙酯层浸膏 24. 0 g，经减压硅胶柱色谱，氯仿-甲醇（ 100 0 11） 溶剂系统梯度洗脱，TLC 检测合并，得到 7 个 流分（ Fr. 1 Fr. 7） 。Fr. 2 经 ODS 中低压柱色谱， 再

6、经制备液相得到化合物 5（ 21. 0 mg） 。Fr. 3 经 SephadexLH-20 凝胶柱色谱氯仿-甲醇 （ 体积比 11） 等度洗脱，ODS 中低压柱色谱，再经制备液相 得到化合物 8（ 8. 5 mg） 和化合物 6（ 56. 0 mg） 。 Fr. 4 经 Sephadex LH-20 凝胶柱色谱甲醇-水（ 体积 比 11） 等度洗脱，ODS 中低压柱色谱，再经制备液 相得到化合物 7（ 8. 5 mg） 和化合物 2（ 5. 0 mg） 。 Fr. 5 经 ODS 中低压柱色谱，Sephadex LH-20 凝胶 柱色谱甲醇-水（ 体积比 1 1） 等度洗脱，再经制备 液相得

7、到化合物 1（ 10. 5 mg） 。Fr. 6 经 ODS 中低 压柱色谱，Sephadex LH-20 凝胶柱色谱甲醇-水（ 体积比 11） 等度洗脱，再经 RP-HPLC 得到化合物 3 （ 8. 0 mg） 和化合物 4（ 6. 8 mg） 。Fr. 7 经重结晶 （ 水） 得到化合物 9（ 50. 6 mg） 3.结构鉴定 分析数据，参比文献，推断化合物分子式二探究骨碎补对破骨细胞骨吸收的影响 1.薄骨片制作处理 取新鲜的牛胫骨放入低 温冰箱储存, 用钢齿锯将其切成薄片, 再磨成 10mg片厚的骨磨片, 在蒸馏水中超声清洗 10m in3 次, 置于双抗液中（青霉素 100g m l

8、, 链 霉素 100g m l） - 30冻存待用。使用时先将其解 冻, 70% 酒精浸泡 30m in, 超净台中紫外线照 1h, 取出加入含M EM 的 24 孔培养板中, 每孔 5 块 4mm 4mm 骨片, 37孵育 1h, 备用。2 . 药物血清的制备 选用普通级 SD 大鼠 20 只, 随机分为A、 B 二组。二组大鼠自由进行饲养, 分别用中药骨碎补提取液和蒸馏水灌胃大鼠, 每 次 2m lg200g, 每天给药两次, 连续给药 3 天, 末次 给药后 1 小时采血。每只大鼠采血约 4 6m l, 分 别装入 20 只无菌离心管内离心。离心后用长头吸 管吸取上清, 同组血清混合匀装

9、入无菌瓶内, 放入 36的水浴箱 30m in 灭活, 放入- 20的冰箱内 保存备用。3.破骨细胞的分离与培养 采用 Fenton 2 等 人的方法加以改良, 选用出生一月龄 SD 雄性大 鼠 2 只, 拉颈处死, 放入 75% 的酒精浸泡 15 分 钟。无菌条件下分离出四肢长骨骨干, 剔除骨干周 围的软组织, 剪断骨干两端骨骺, 在装有纯M EM 的培养液的培养皿中清洗骨干并转移到另外一个 盛有纯M EM 的培养液的培养皿中, 用注射器抽 取纯M EM 反复冲洗骨髓腔, 冲洗不少于 3 次, 将 得到有细胞的悬液用 200 目的筛网过滤两遍后, 放入无菌离心管内离心（1000rpm , 1

10、0m in）。去上 清后, 用含有M EM 培养液稀释离心后沉淀的细 胞, 并在显微镜下计数, 调至细胞数为 1106g m l 后, 继续孵育3 。3.骨吸收陷窝的测定 将细胞悬液放入盛有 牛骨片的 24 孔培养板中, 每孔含 5 片骨片, 倒置 显微镜观察见有大量的细胞后, 放入体积分数为 37 C, 5%CO 2 的培养箱中, 24 小时后更换培养 液, 洗去未贴壁的细胞, 更换培养液: 第一组加含 20% 中药骨碎补药物血清的培养液; 第二组加含 10% 中药骨碎补药物血清的培养液; 第三组加含 空白血清的培养液。每 24 小时换液 1m l。6 天后, 取出骨片, 以体积分数为 2.

11、 5% 戊二醛固定 30m in, 以质量分数为 0. 1% 甲苯胺蓝硼酸盐溶液 染色 2m in。然后分别置入 0. 25molg L 的氨水中, 超声振荡 2m in 以上, 用上述染液复染 5m in 4 , 丙 酮脱水。L eica Q uantim et500 图像分析仪检测骨 吸收陷窝面积和记录骨吸收陷窝数目。4.数据处理三研究骨碎补在动物骨伤愈合中对骨痂组织的作用效果1.将 60只雄性小鼠随机分成三组: 生理盐水组（A ）、骨碎补组（B）、伤 科接骨片组（C）。按标准骨折模型方法造模, 不作任何外固定, 分笼饲养。从手术后第二天开始灌胃给药, 骨碎 补组每天以骨碎补水煎液分早晚

12、2 次灌胃, 伤科接骨片组每天给药 2 次, 对照组同时给予等量生理盐水。于术 后第 7 天、14 天、21 天每组分别处死动物 4 只, 取出骨标本。骨标本制成切片测量骨痂厚度及TGF2 1 免疫组 化染色。2.骨标本的制备及检测项目 动物处死后, 以 实验骨折处为中心, 取长度约 1cm 的胫骨骨干, 置于 4% 的多聚甲醛溶液中, 4下固定 48 小时, 再于 15% 的 EDTA 溶液中脱钙 14 天, 1 周时更 换脱钙液。取材, 经梯度酒精逐级脱水后浸蜡, 石 蜡纵向包埋、切片, 厚度为 5m , 部分切片进行 HE 染色并作组织学观察及骨痂厚度测量, 部分 切片进行 TGF2 1

13、 免疫组化染色。3.骨痂厚度测量 在 100 倍镜下, 每张切片 以骨折为中心选取 10 个视野, 用目镜测微尺测量 骨痂厚度并计算平均值。 2 . 2 . 2TGF2 1 免疫组化染色切片脱蜡至水, 置于新鲜配制的 3%H 202 溶液中, 室温下 10 分钟 以灭活内源性过氧化酶, 滴加复合消化液 5 10 分钟, 再滴加 5% 山羊血清封闭液, 置入生物医学 实验仪, 用第 2 档辐射 30 秒。滴加 1100 稀释的 兔抗鼠TGF2 1 抗体 , 第 3 档辐射 50 秒, 复温后用 0. 01M PBS 溶液冲洗。滴 加 1200 生物素化羊抗兔抗体, 第 3 档辐射 50 秒, 用

14、 0. 01M PBS 溶液冲洗。滴加试剂 SABC, 第 3 档辐射 45 秒, 用 0. 01M PBS 溶液冲洗。DAB 显 色, 复染, 脱水, 透明, 封片, 显微镜观察。（二）拟解决的关键问题1.分析并对骨碎补化学组成中有效成分进行分离提纯2.找到骨碎补的最佳作用浓度3比对白兔在骨伤愈合中骨碎补对骨痂组织的作用效果4.分析总结总结骨碎补在分子水平的作用机理（3）创新点 1.采取化学分析并提纯中草药骨碎补的有效成分 2.确定了骨碎补的最佳作用浓度 3.从分子水平研究骨碎补对骨伤组织愈合的作用机理三、项目实施方案（研究思路、技术路线、研究方法等）（一）研究思路1.分析骨碎补的化学组成，

15、生物活性成分。2.采用破骨成骨细胞共培养体添加不同浓度的骨碎补提取物, 发现骨碎补提取物对骨细胞作用的最佳浓度，骨碎补组不同基因不同的作用时间点与强度。3.运用活体动物实验，检测骨标本制成切片测量骨痂厚度及TGF21的含量，分析骨碎补在骨痂组织中的作用机制。（二）技术路线1.对骨碎补化学成分的提纯鉴定 采用硅胶柱色谱、SephadexLH-20 柱色 谱、中低压 ODS 柱色谱及制备液相等方法进行分离纯化，并根据化合物的理化性质及波谱数据对结构进行鉴定。2.体外分离出破骨细胞, 与牛骨磨片共同培养, 通过L eica 图像分析仪观察破骨细胞所形成骨吸收陷窝的数目与面积, 反映破骨细胞性骨吸收情 况。结果用 SPSS 软件包分析3.探究骨碎补的作用机理 采用活体动物实验，标本制备和各项指标测定（三）研究方法1.通过化学分析得到骨碎补的有效成分2.体外分离