qPCR的原理_精品文档.doc

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原理

（1）PCR：

Polymerasechainreaction.是体外模拟生物的DNA复制。

需

要DNA聚合酶，DNA模板，两端引物，脱氧核苷酸dNTPs（dATP,ACTP,dGTP,

dTTP）,以及适当的缓冲体系。

PCR产物的增长形式为２N（如果各种试剂和外部所加条件均理想化，N是

循环数）。

实际中，扩增效率不为100％。

RealtimePCR是定量PCR的一种，当然是在PCR的基础上发展出来的。

（普

通）PCR包含很多因素，属性，如：

试剂，温度，循环数，程序，PCR产物（扩

增子，amplicon）的量，扩增曲线（扩增子累积曲线），掺错率，扩增子长度。

一般来说，人们关心的是扩增子的量。

而realtimePCR主要利用的是扩增曲线

（amplificationcurve）,循环数；扩增子长度，扩增效率，扩增子多少，也加以

考虑。

普通PCR是在扩增完以后，（无论多少个循环），进行电泳，染色。

对于判

断目的DNA有没有，是出色的。

但对于检测目的DNA有多少分子（初始的时

候），则勉为其难。

因为PCR的理想和实际仍相差一段距离。

理论界普遍认为，

PCR的起始若干循环内，由于原料，酶的充足，抑制子（抑制PCR的因素，如dNTPs分解产生焦磷酸）的量少，PCR可以是理想的——即每个循环后扩增子

增加一倍。

然而到了一定时候，原料和酶相对于模板大大减少，抑制子浓度也相

对较高，PCR的效率就会降低，直至为0。

所以实际的扩增曲线是“S”型的，

而不是“J”型。

图2：

扩增曲线。

理想：

J型，2N方程。

实际：

S型。

分为：

不可检测期，指数期，平台期。

这个扩增曲线，据说最初是用以下办法得到的：

配好若干（如40）相同的

PCR体系，分别进行1，2，3……40个循环，再用测OD等定量方法来知道有多

少扩增子产生，作图。

由于对极少量DNA（1~数千？

）的直接定量办法还没有，该扩增曲线的最初

若干循环，扩增子的量标为0，表示难以同背景干扰分开。

RealtimePCR同样不能直接测出初始DNA的分子数，不过，它采用的数据

是在PCR中期，比末期定量要准确。

（更接近理想情况。

）

（2）RealtimePCR的化学基础

realtimePCR是普通PCR的一项改进，使用了针对扩增DNA的荧光物质，

使得DNA的数量与检测到的荧光强度成线性关系，大致得到DNA的扩增曲线

（如，图2，3）。

图3：

realtimePCR的扩增曲线。

名词解释：

•Rn:

一个反应管经n次热循环后，测得的荧光强度。

（NormalizedwithROX-参比染料。

）

•Rn+:

反应管含有模板DNA。

•Rn-:

反应管不含有模板DNA。

•无模板对照：

Notemplatecontrol，Rn-，理想情况下，是一条平线，只具有背景荧光数

值。

•Threshold:

荧光（Rn）超过本底——达到可检测水平时的临界数值。

•Ct:

thresholdcycle，临界循环数，threshold横线与扩增曲线相交，所得交点所对应的循

环数。

•基线：

baseline,是背景曲线的一段，范围——从反应开始不久荧光值开始变得稳定，直

到所有反应管的荧光都将要，但是还未，超出背景。

）