免疫组化详细步骤_精品文档.doc

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免疫组化步骤

取组织、固定、制片（脱水、透明、浸蜡、包埋）、切片、烤片、抗原修复、滴加抗体

一、取组织

二、固定

三、制片

1、脱水透明的酒精梯度和时间

70%酒精20min80%酒精1h

90%酒精1h95%酒精Ⅰ2h

95%酒精Ⅱ2h 无水乙醇Ⅰ15min

无水乙醇Ⅱ15min无水乙醇Ⅲ15min

二甲苯酒精1:

115min二甲苯Ⅰ25min

二甲苯Ⅱ25min二甲苯Ⅲ15min

2、浸蜡：

石蜡融化后，在石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各浸蜡1h

3、包埋

四、切片烤片

用切片机切片，取完整组织切片放于37℃温水中展片，取完整组织于载玻片上，并放入到60℃的烤箱中烤6个小时

五、脱蜡至水

六、抗原修复

配置柠檬酸抗原修复液于微波中煮沸，在高压锅内放入自来水煮沸（不盖锅盖），将装有煮沸的抗原修复液的烧杯置于高压锅内，将水化后的玻片放入煮沸的抗原修复液中，盖上锅盖，待其压力达到最大时维持三分钟

七、取出玻片，水浴逐渐降温直至完全冷却

八、将玻片放置于塑料板上，滴加3%的过氧化氢室温孵育10min，以阻断内源性过氧化氢酶，10min过后PBS冲洗2次×3分钟

九、除去PBS（甩干或者吸水纸吸干），每张切片滴加第一抗体（稀释相应倍数），4℃过夜

十、PBS冲洗3次×2分钟，除去PBS液，每张切片滴加聚合物增强剂，室温孵育10min

十一、PBS冲洗2分钟×3次，除去PBS，每张切片滴加酶标抗兔聚合物，室温孵育10min

十二、PBS冲洗2分钟×3次，除去PBS，每张切片滴加新配制的DAB（二氨基联苯胺），室温孵育2~10分钟，显微镜观察

十三、苏木精复染：

苏木精复染5min，水洗3min，0.1%HCl浸提两次，水洗3min，反蓝液数秒，水洗

十四、脱水透明：

70%酒精3min、80%酒精3min、90%酒精3min、无水乙醇3min、二甲苯Ⅰ3min、二甲苯Ⅱ3min

十五、封片