缓冲液的配制培训资料Word文档格式.docx
《缓冲液的配制培训资料Word文档格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《缓冲液的配制培训资料Word文档格式.docx（11页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
密封盖好，4°
C存放备用
4、ELISA底物液（可溶性底物）
磷酸-柠檬酸缓冲液pH5.0
0.1mol/L柠檬酸（21.014克/100ML）——24.3ml；
0.2mol/LNa2HPO4（28.4克
/L）——25.7ml；
H2O——50ml；
4C存放备用
5、DAB底物液（不溶性底物，组化病理等）0.05mol/LpH7.6tris-HCL
Tris——6.05克；
HCL（36%）——3.15克（约2.7ml浓HCL）；
H2O至1000ml
DAB为3'
3'
二氧基联苯胺，不溶性底物，呈棕红色
ELISA试剂配制及实验流程
是酶联接免疫吸附剂测定（（Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay）的简称。
以双抗体夹心法举例说明。
试剂配制：
（1）包被缓冲液（PH9.6+0.20.05M碳酸盐缓冲液）：
Na2CO3——
1.59g;
NaHC03——2.93g;
加蒸馏水至1000ml。
（用时稀释成1x,加
0.1%BSA）
⑵洗涤缓冲液（PH7.40.15MPBST）:
0.05%Tween-20.5ml;
加在PBS缓冲
液1000ml中。
PBS缓冲液：
KH2PO4——0.2g;
Na2PO432H2O——2.9g;
NaCl——8g;
KCl——0.2g;
加蒸馏水至1000ml。
（3）封闭缓冲液：
牛血清白蛋白（BSA）2%——2g;
（或5%脱脂奶粉）加洗涤缓
冲液100ml。
（4）稀释液：
牛血清白蛋白0.1%——0.1g;
加PBS缓冲液100ml。
（5）底物缓冲液（PH5.0）：
0.2MNa2HPO4（无水28.4g/L，带12结晶水
71.7g/L）取25.7ml0.1M柠檬酸（无水19.2g/L，带1结晶水21.01g/L）取24.3ml;
加蒸馏水至100ml。
（或Na2HPO412H2O——1.84g;
柠檬酸-H2O——0.51g加蒸馏水至100ml）
（6）TMB（四甲基联苯胺）显色液（显蓝色）：
TMB（2mg/ml水）——0.05ml;
底物缓冲液——0.95ml;
30%H2O2——0.001ml;
总体积1ml。
（7）或配OPD（邻苯二胺）显色液（显黄棕色）（现配避光）：
OPD（干粉）一一
0.004g;
底物缓冲液——10ml;
30%H2O2——0.015ml;
总体积——10ml。
（8）终止液（2MH2SO4）:
在178.3ml水中，逐滴加入浓硫酸（18M，约98%）21.7ml,边加边摇。
1.包被：
用包被液将抗体（一抗）稀释至蛋白质含量为1~10g/ml。
在每板的
反应孔中加0.1ml，4C过夜（或37C温育2~3小时）。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗3次，中间振荡。
（简称洗涤，下同）。
2.封闭：
加0.3ml封闭液于上述已包被之反应孔中，置37C温育2小时。
然后洗涤3次
3.加样：
加待检样品0.1ml于反应孔中，置37T温育1~2小时。
然后洗涤。
（同时做空白孔（不加样品），阴性对照孔（野生型）及阳性对照孔）。
4.加一抗：
各反应孔中加入新稀释的抗体0.1ml。
置37E温育1~2小时。
然后洗涤。
5.加酶标二抗：
各反应孔中加入新稀释的酶标抗体0.1ml。
37°
C温育45分钟~1小时，洗涤5次。
6.加底物液显色：
各反应孔中加入刚刚配制的TMB底物溶液0.1ml（或OPD显色液），37C暗处温育5~20分钟，或室温暗处10~40分钟充分变色。
7.终止反应：
各反应孔中加入2M硫酸0.05ml°
（TMB底物蓝色变黄色，OPD底物黄色变棕色）
8.结果判定：
白色背景上肉眼直接观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，可以依据所呈颜色的深浅，用“+”、-“”号表示测
OD值：
在ELISA检测仪上，TMB底物法使用450nm测各孔OD值，OPD底物法使用492nm检测。
通常大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性（以空白对照孔调零后计算）。
4间接法
用包被液将样品稀释（梯度稀释，比例自己定）4C过夜（或37C温
育2~3小时）。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗3次（5至7次），中间振荡。
3.加一抗：
4.加酶标二抗：
5.加底物液显色：
6.终止反应：
7.结果判定：
孕酮
1包被缓冲液，
（1）碳酸盐缓冲液（PH9.6+0.20.05M）
（2）tris缓冲液（0.05mol/L）50ml0.1mol/L（Tris）溶液与xml0.1mol/L盐酸
混匀后，加水稀释至100ml
各种pH值的Tris缓冲液的配制
所需pH值（25C）
0.1mol/LHCl的体积
7.1
45.7
7.2
44.7
7.3
43.4
7.4
42.0
7.5
40.3
7.6
38.5
7.7
36.6
7.8
34.5
7.9
32.0
8.0
29.2
8.1
26.2
8.2
22.9
8.3
19.9
8.4
17.2
8.5
14.7
8.6
12.4
8.7
10.3
8.8
8.9
7.0
某一特定pH值的0.05mol/LTris缓冲液的配制：
将50ml0.1mol/LTris碱溶液与
上表所示相应体积（单位：
ml）的0.1ml/LHCl混合，加水将体积调至100ml
0.1mol/L盐酸的配置：
买来的浓盐酸是12mol/L的，以配制1L0.1mol/L的盐酸为例：
先用量筒量取8.3mL的浓盐酸倒入容量瓶，然后将溶液加蒸馏水稀释至体积为1L,此时的溶液就是0.1mol/L的盐酸。
0.1mol/Ltris的配置：
0.1mol/L溶液为12.114g/L则配制600mlTris缓冲液的方法：
三羟甲基氨基甲烷：
3.6g
浓盐酸：
2.09ml
3）0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）
磷酸二氢钾——0.2g;
磷酸氢二钠——2.90g；
氯化钠——8g；
加去离子水定容到1000ml。
2洗涤缓冲液（pH7.40.15mol/L）
0.05%Tween-20.5ml;
加在PBS缓冲液1000ml中。
KH2PO4——0.2g；
Na2HPO412H2O——2.9g；
NaCl——8.0g；
KCl——0.2g加蒸馏水至1000ml。
3测定缓冲液（Ph7.0含0.87%NaCl和0.1%BSA的0.1M磷酸缓冲液）用于标准孕酮，孕酮酶标物及奶样的稀释。
Na2HPO412H2O——21.85g；
NaH2PO42H2O——6.08g；
NaCl——
8.70g；
BSA——1.00g溶于1000mL蒸馏水中
4封闭缓冲液
牛血清白蛋白（BSA）2%――2g；
（或5%脱脂奶粉）加洗涤缓冲液100ml。
0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.6）+2.0%BSA
2.0gBSA加配好的0.05mol/L碳酸盐缓冲液溶解定量至100ml
5底物缓冲液（pH5.4）磷酸盐-柠檬酸缓冲液
0.2MNa2HPO4（无水28.4g/L，带12结晶水71.7g/L）取25.7ml
0.1M柠檬酸（无水19.2g/L，带1结晶水21.01g/L）取24.3ml加蒸馏水至100ml。
或柠檬酸（C6H8O7H2O）——0.47g；
Na2HPO412H2O——2.00g；
6
（1）TMB（四甲基联苯胺）显色液（蓝色）
A液（3,3'
5,5'
-四甲基联苯胺，TMB）:
称取TMB20mg溶于10ml无水乙醇
中，完全溶解后，加双蒸水至100ml
B液（O.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲液，pH5.0-5.4）:
称取
Na2HPO432H2O14.34g，柠檬酸1.87g溶于180ml双蒸水，加0.75%过氧化氢尿素1.28ml，定容至200ml，调pH至5.0-5.4。
将A液和B液按1：
l混合后即成TMB-过氧化氢尿素应用液或TMB（2mg/ml水）
——0.05ml:
底物缓冲液——0.95ml;
30%H2O2——0.001ml;
总体积1ml。
（2）OPD（邻苯二胺）显色液（黄棕色）（现配避光）
OPD（干粉）——0.004g；
底物缓冲液——10ml；
30%H2O2——
0.015ml；
总体积10ml。
（3）TMBS底物液（用于显色）
10mg四甲基联苯胺硫酸盐（TMBS）的二甲基亚砜溶液，用底物缓冲液配成
0.2mg/ml的TMBS底物液。
用前加H2O2溶液30%左右。
7终止液2mol/LH2SO4用于终止反应
在178.3ml水中，逐滴加入浓硫酸（18M，约98%）21.7ml，边加边摇。
（浓
H2SO4:
蒸馏水=1:
9）
抗原修复液：
根据待检测的抗原，选择适当的方法
附:
抗原修复液（10mMpH6.0枸橼酸钠缓冲液）的配制
（1）储备液的配制:
A:
枸橼酸三钠-2H2O29.41g+1000ml
B:
枸橼酸21g+蒸馏水1000ml
工作液的配置：
A液82ml+B液18ml+蒸馏水900ml抗原修复方法:
高压锅处理技术：
枸橼酸钠缓冲液（10mM,PH6.0）,淹没切片，盖上高压锅，
高压锅内煮沸，上汽3分钟后缓慢冷却（可用自来水在高压锅外冲，以助冷却）微波处理技术：
用塑料切片
升级会员 