缓冲液的配制培训资料Word文档格式.docx

1、密封盖好， 4C 存放备用4、 ELISA 底物液（可溶性底物）磷酸-柠檬酸缓冲液 pH5.00.1mol/L 柠檬酸（21.014克/100ML） 24.3ml ； 0.2mol/L Na2 HPO4 （28.4克/L）25.7ml； H2O 50ml；4 C存放备用5、 DAB 底物液（不溶性底物，组化病理等） 0.05mol/L pH7.6 tris-HCLTris 6.05 克；HCL（36%）3.15 克（约 2.7ml 浓 HCL）； H2O 至 1000mlDAB为3,3二氧基联苯胺，不溶性底物，呈棕红色ELISA 试剂配制及实验流程是酶联接免疫吸附剂测定 （ Enzyme-Li

2、nked Immunosorbnent Assay ）的简称。以双抗体夹心法举例说明。试剂配制：（1） 包被缓冲液 （PH9.6 +0.2 0.05M 碳酸盐缓冲液 ） ： Na2CO31.59g ;NaHC03 2.93g ;加蒸馏水至1000ml。（用时稀释成1x,加0 . 1 %BSA）洗涤缓冲液（PH7.4 0.15M PBST）: 0.05%Tween-2 0.5ml;加在 PBS缓冲液 1000ml 中。PBS缓冲液：KH2PO40.2g ; Na2PO432H2O2.9g ;NaCl8g ; KCl0.2g; 加蒸馏水至 1000ml。（3） 封闭缓冲液：牛血清白蛋白 （BSA）

3、2%2g ;（或 5%脱脂奶粉）加洗涤缓冲液 100ml。（4） 稀释液 ：牛血清白蛋白 0.1 % 0.1g ;加 PBS 缓冲液 100ml。（5） 底物缓冲液（PH5.0）： 0.2M Na2HPO4（无水28.4g/L，带12结晶水71.7g/L）取 25.7ml 0.1M 柠檬酸（无水 19.2g/L，带 1 结晶水 21.01g/L）取 24.3ml;加蒸馏水至100ml。（或Na2HPO412H2O 1.84g ;柠檬酸-H2O 0.51g加 蒸馏水至 100ml）（6） TMB（四甲基联苯胺）显色液（显蓝色）：TMB（2mg/ml水） 0.05ml;底物 缓冲液 0.95ml;

4、 30% H2O2 0.001ml ;总体积 1ml。（7） 或配OPD（邻苯二胺）显色液（显黄棕色）（现配避光）： OPD （干粉）一一0.004g ;底物缓冲液 10ml ; 30% H2O2 0.015ml ;总体积 10ml。（8） 终止液（2M H2SO4）:在178.3ml水中，逐滴加入浓硫酸（18M，约 98%）21.7ml,边加边摇。1.包被：用包被液将抗体（一抗）稀释至蛋白质含量为 110g/ml。在每板的反应孔中加0.1ml，4C过夜（或37C温育23小时）。次日，弃去孔内溶 液，用洗涤液冲洗 3次，中间振荡。 （简称洗涤，下同 ）。2.封闭：加0.3ml封闭液于上述已包被

5、之反应孔中，置 37C温育2小时。然后 洗涤 3 次3.加样：加待检样品0.1ml于反应孔中，置37T温育12小时。然后洗涤。（同 时做空白孔（不加样品），阴性对照孔（野生型）及阳性对照孔 ）。4.加一抗：各反应孔中加入新稀释的抗体 0.1ml。置37E温育12小时。然后 洗涤。5.加酶标二抗：各反应孔中加入新稀释的酶标抗体 0.1ml。37C温育45分钟1 小时，洗涤 5次。6.加底物液显色：各反应孔中加入刚刚配制的 TMB底物溶液0.1ml （或OPD 显色液），37C暗处温育520分钟，或室温暗处1040分钟充分变色。7.终止反应：各反应孔中加入 2M硫酸0.05ml（ TMB底物蓝色变

6、黄色，OPD 底物黄色变棕色）8.结果判定：白色背景上肉眼直接观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越 强，阴性反应为无色或极浅，可以依据所呈颜色的深浅，用“ +”、-“”号表示测OD值：在ELISA检测仪上，TMB底物法使用450nm测各孔OD值，OPD底 物法使用492nm检测。通常大于规定的阴性对照 OD值的2.1倍，即为阳性（以 空白对照孔调零后计算 ）。4 间接法用包被液将样品稀释（梯度稀释，比例自己定） 4C过夜（或37C温育23小时）。次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗 3次（5至 7次），中间振 荡。3.加一抗：4.加酶标二抗：5.加底物液显色：6.终止反应：7.结果判定：孕酮1

7、包被缓冲液，（ 1）碳酸盐缓冲液（ PH9.6 +0.2 0.05M）（2）tris 缓冲液（0.05mol/L） 50ml 0.1mol/L （Tris）溶液与 x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml各种pH值的Tris缓冲液的配制所需pH值（25C）0.1mol/L HCl 的体积7. 145. 77. 244. 77. 343. 47. 442. 07. 540. 37. 638. 57. 736. 67. 834. 57. 932. 08. 029. 28. 126.28.222.98.319.98.417.28.514.78.612.48.710.38.88.9

8、7.0某一特定pH值的0.05mol/L Tris缓冲液的配制：将 50ml 0.1mol/L Tris碱溶液与上表所示相应体积（单位：ml）的0.1ml/L HCl混合，加水将体积调至100ml0.1mol/L盐酸的配置：买来的浓盐酸是12 mol/L的，以配制1L 0.1mol/L的盐酸为例：先用量筒量取8.3 mL的浓盐酸倒入容量瓶，然后将溶液加蒸馏水稀释至体积为 1 L,此时的溶液就是0.1mol/L的盐酸。0.1mol/Ltris 的配置：0.1 mol/L 溶液为 12.114 g/L 则配制600mlTris缓冲液的方法：三羟甲基氨基甲烷：3.6g浓盐酸： 2.09ml3）0.0

9、2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）磷酸二氢钾0.2g ;磷酸氢二钠 2.90g；氯化钠8g；加去离子水定 容到 1000ml。2 洗涤缓冲液 （pH7.4 0.15mol/L）0.05%Tween-2 0.5ml;加在 PBS 缓冲液 1000ml 中。KH2PO4 0.2g； Na2HPO412H2O2.9g； NaCl 8.0g；KCl 0.2g加蒸馏水至1000ml。3测定缓冲液（Ph7.0含0.87% NaCl和0.1 % BSA的0.1M磷酸缓冲液）用于标 准孕酮，孕酮酶标物及奶样的稀释。Na2HPO412H2O 21.85g； NaH2PO4 2H2O6.08g； NaCl 8

10、.70g； BSA 1.00g溶于1000mL蒸馏水中4 封闭缓冲液牛血清白蛋白（BSA） 2%2g；（或5%脱脂奶粉）加洗涤缓冲液100 ml。0.05mol/L 碳酸盐缓冲液 （pH9.6）+2.0%BSA2.0gBSA加配好的0.05mol/L碳酸盐缓冲液溶解定量至100ml5底物缓冲液（pH5.4）磷酸盐-柠檬酸缓冲液0.2M Na2HPO4（无水 28.4g/L，带 12 结晶水 71.7g/L）取 25.7ml0.1M 柠檬酸（无水19.2g/L，带1结晶水21.01g/L）取24.3ml 加蒸馏水至 100ml。或柠檬酸（C6H8O7 H2O） 0.47g； Na2HPO4 12

11、H2O2.00g；6 （1） TMB（四甲基联苯胺）显色液（蓝色）A液（3, 3,5, 5-四甲基联苯胺，TMB）:称取TMB20mg溶于10ml无水乙醇中，完全溶解后，加双蒸水至 100mlB液（O.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲液，pH5.0-5.4）:称取Na2HPO4 32H2O14.34g，柠檬酸1.87g溶于180ml双蒸水，加0.75%过氧化氢 尿素 1.28ml，定容至 200ml，调 pH 至 5.0-5.4。将A液和B液按1： l混合后即成TMB-过氧化氢尿素应用液或 TMB（2mg/ml水） 0.05ml:底物缓冲液 0.95ml; 30% H2O2

12、0.001ml;总体积1ml。（2） OPD（邻苯二胺）显色液（黄棕色）（现配避光）OPD （干粉） 0.004g；底物缓冲液 10ml； 30%H2O20.015ml；总体积 10ml。（3） TMBS 底物液（用于显色）10mg四甲基联苯胺硫酸盐（TMBS）的二甲基亚砜溶液，用底物缓冲液配成0.2mg/ml的TMBS底物液。用前加 H2O2溶液30%左右。7 终止液 2mol/L H2SO4 用于终止反应在178.3ml水中，逐滴加入浓硫酸（18M，约98%）21.7ml，边加边摇。（浓H2SO4:蒸馏水=1:9）抗原修复液：根据待检测的抗原，选择适当的方法附:抗原修复液（ 10mM pH6.0 枸橼酸钠缓冲液）的配制（1）储备液的配制:A :枸橼酸三钠-2H2O 29.41g+1000mlB:枸橼酸21g+蒸馏水1000ml工作液的配置：A液82ml+B液18ml+蒸馏水900ml 抗原修复方法: 高压锅处理技术：枸橼酸钠缓冲液（ 10mM,PH6.0） ,淹没切片，盖上高压锅，高压锅内煮沸，上汽 3 分钟后缓慢冷却（可用自来水在高压锅外冲，以助冷 却） 微波处理技术：用塑料切片