红霉素对哮喘大鼠外周血单个核细胞磷酸化JNK表达的影响Word文件下载.docx

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探讨哮喘大鼠外周血单个核细胞（PBMCs）JNK磷酸化表达的变化及红霉素对其影响。

方法：

分离培养正常对照组、哮喘组、红霉素处理组大鼠的PBMCs。

分别采用ELISA方法检测细胞上清液中IL-4，IL-5浓度，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、WesternBloting技术检测PBMCsJNKmRNA、磷酸化JNK的表达。

结果：

哮喘组PBMCsJNK磷酸化蛋白、mRNA表达水平及细胞上清液中IL-4，IL-5的浓度较正常对照组显著升高（P0.05），红霉素处理组JNKmRNA、磷酸化蛋白表达水平及细胞上清液中IL-4，IL-5的浓度较哮喘组显著降低（P0.05）。

通过直线相关分析发现，PBMCsJNK磷酸化蛋白与细胞上清液中IL-4，IL-5的表达水平之间均呈显著正相关（r分别为0.74和0.66，P均0.05）。

结论：

JNK可能参与支气管哮喘的病理生理过程。

红霉素可能通过作用于JNK这一靶点发挥其抗炎效应。

【关键词】支气管哮喘;

外周血单个核细胞;

JNK蛋白激酶;

红霉素　　Abstract:

Objective:

TostudythechangesoftheexpressionofJNKmitogen-activatedproteinkinase（JNK-MAPK）inperipheralbloodmononuclearcells（PBMCs）inratswithasthmaandtheeffectsoferythromycinonit.Methods:

PBMCswerecollectedandculturedfromratswithasthma，normalsubjectsanderythromycin-treatedgroup.ThelevelsofproteinofIL-4，IL-5inplasma，JNKmRNAandproteinofJNKinPBMCsweredetectedwithenzymelinkedimmunosorbentassay（ELISA），reversetranscriptionpolymerasechainreaction（RT-PCR）andwesternbloting（WB），respectively.Results:

TheexpressionofJNKmRNA、phosphor-JNKinPBMCsandtheconcentrationofIL-4，IL-5insupernatantswerehigherinasthmaticgroupthanthoseinnormalgroup（P0.05）.Byerythromycintreated，theaboveindexesweredecreasedsignifi-cantlycomparedwiththoseinasthmaticgroup（P0.05）.Therewerepositivecorrelationsbetweentheexpressionofphosphor-JNKandtheconcentrationofIL-4，IL-5insuper-natants（r=0.74，0.66，P0.05）.Conclusion:

JNKmayplayaroleinpathophysiologicalprocessofasthma.Erythromycincaneffectivelytreatasthmathroughinhibitingtheexpressionofp-JNK.　　Keywords:

asthma;

peripheralbloodmononuclearcells;

JNKmitogen-activated　　proteinkinase;

erythromycin　　支气管哮喘是多种炎性细胞和细胞因子参与的气道慢性炎症。

炎症学说的确立，给哮喘的防治和研究带来了很大的进展。

已有的研究发现，淋巴细胞等炎症细胞及其产生的多种细胞因子（IL-4和IL-5等）和炎症递质参与了哮喘的发病过程[1]。

以红毒素、罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素等为代表的14环、15环大环内酯类抗生素对支气管哮喘有较好的治疗作用，可以改善哮喘患者的临床症状，降低气道高反应性。

然而其确切的作用机制尚未明确，有文献表明，其抗哮喘作用可能与非抗菌性抗炎作用有关[2-3]。

但有关红霉素对哮喘患者外周血单个核细胞（PBMCs）JNK表达的影响目前尚未见报道，本研究通过复制卵白蛋白（OVA）致敏的哮喘大鼠模型，探讨红霉素对哮喘大鼠外周血单个核细胞JNK表达的影响。

　　1材料和方法　　1.1材料OVA（Sigma公司）;

乳糖酸红霉素（大连美罗制药公司）;

磷酸化JNK和JNK多克隆抗体（SantaCruz公司）;

Western细胞裂解液、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗、BCA蛋白定量试剂盒、PVDF膜（江苏碧云天生物技术研究所）;

蛋白电泳转移系统（Bio-Rad公司）;

IL-4和IL-5的ELISA试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）;

Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司）;

JNK和β-actin引物（上海生工生物技术公司）。

　　1.2动物实验分组及模型复制SPF级雄性SD大鼠30只，6～8周龄，体重250～300g（购自温州医学院实验动物中心）。

随机分为正常对照组、哮喘组和红霉素处理组，每组10只。

哮喘组及红霉素处理组动物均复制哮喘模型：

在第1、第8天腹腔注射1mLOVA/Al（OH）3混合液[内含OVA1mg和的Al（OH）3100mg]致敏，致敏2周后开始应用空气压缩雾化器于密闭有机玻璃容器中以1%的OVA生理盐水溶液雾化激发，每次30min，每周3次，共持续8周。

正常对照组参照上述方法，只是致敏与激发时均以生理盐水代替。

模型制备主要参考文献[4]。

　　1.3PBMCs分离、培养无菌抽取肝素（30U/mL）抗凝大鼠下腔静脉血5mL，以淋巴细胞分离液分离PBMCs。

离心洗涤后，用RPMI-1640培养基调细胞浓度为1×

106/L，培养体系中加刺激物PHA10μg/mL，接种于6孔培养板内，相应分为正常对照组、哮喘组和红霉素处理组（即加入终浓度为15μg/mL的红霉素共同培养）。

置于5%CO2、37℃培养箱内培养48h，收集细胞和细胞上清液备用，-70℃保存。

　　1.4培养上清中IL-4和IL-5测定采用ELISA法检测各组培养上清液中IL-4和IL-5的表达水平，操作按试剂盒说明书进行。

　　1.5PBMCs中JNKmRNA检测JNK上游引物为：

5’-CCAGATTGGATATTTCCGTCAG-3’，下游引物：

5’-TTCCCAGTCCATCACTTCG-3’（产物片段长度为277bp）;

β-actin上游引物为5’-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3’;

下游引物为：

5’-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3’（产物片段长度为412bp）。

用Invitrogen公司的Trizol试剂盒，按说明书介绍的方法提取总RNA，按Takara公司说明书的操作步骤逆转录合成cDNA。

PCR循环条件为：

94℃预变性5min，94℃变性30s，不同退火温度（JNK55℃，β-actin58℃）退火30s，72℃延伸1min，共35个循环;

循环结束后继续于72℃内延伸5min，于-20℃保存备用。

反应产物在1.5%琼脂糖中进行电泳，以β-actin为内参照，采用QuantityOne软件对各电泳条带的光密度进行半定量分析。

　　1.6PBMCs中JNK蛋白水平的检测采用蛋白免疫印迹法从6孔培养板中提取PBMCs，用Western细胞裂解液抽提PBMCs的全细胞蛋白样品，并经BCA法测定蛋白质浓度，煮沸变性后以30μg/孔上样经4%积层胶后于10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）胶上电泳分离后转移至PVDF（聚偏氟乙烯）膜上;

50g/L脱脂牛奶封闭4h，以适当比例稀释的抗JNK一抗孵育4℃过夜后洗脱，适当比例稀释的辣根过氧酶标记的二抗于室温1h孵育、洗脱后采用BeyoECLPlus试剂进行化学发光法显色，之后曝光显影。

采用美国BIO-RAD公司QuantityOne分析软件对显影条带进行灰度分析，将目的蛋白与β-actin灰度比值作为目的蛋白的相对表达水平。

　　1.7统计学处理方法组间比较采用方差分析。

两变量之间的相关程度采用直线相关分析。

　　2结果　　2.1各组培养上清液中IL-4以及IL-5的浓度差异用ELISA方法检测哮喘组细胞上清液中IL-4、IL-5的浓度较正常对照组显著升高（P0.05），红霉素处理组细胞上清液中IL-4以及IL-5的浓度较哮喘组显著降低（P0.05）（见表1）。

　　2.2JNK基因表达结果逆转录PCR结果显示，哮喘组PBMCsJNKmRNA表达水平较正常对照组显著升高（P0.05），红霉素处理组JNKmRNA表达水平较哮喘组显著降低（P0.05）（见表2及图1）。

　　2.3蛋白质印迹法结果哮喘组PBMCs磷酸化JNK蛋白表达水平较正常对照组显著升高（P0.05），红霉素处理组磷酸化JNK蛋白表达水平较哮喘组显著降低（P0.05）。

见表2和图2。

　　2.4PBMCs磷酸化JNK蛋白表达和培养上清液中IL-4和IL-5蛋白质含量之间的相关分析通过直线相关分析发现，PBMCs磷酸化JNK蛋白表达与培养上清液中IL-4和IL-5蛋白质含量之间均呈显著正相关（r分别为0.74和0.66，P均0.05）。

　　3讨论　　丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）作为真核细胞转导细胞外信号到细胞内的四大信号系统之一，在信号转导过程中发挥重要作用。

作为MAPK家族信号系统一员的JNK，是重要的细胞信号分子之一，经上游激酶激活后由胞质移位至胞核，活化包括转录因子在内的多种效应蛋白，参与细胞增殖和凋亡的调节[5]。

Wuyts等[6]研究显示JNK通道参与哮喘发病机制过程，并涉及哮喘气道慢性炎症、气道高反应性等多个方面。

本实验结果显示JNKmRNA、磷酸化蛋白表达水平较正常对照组显著升高，提示JNK通道参与哮喘发病机制过程，与Wuyts等[6]的研究结果相符。

本实验结果同时显示JNK在基因、蛋白水平均参与哮喘的发病过程。

　　目前认为哮喘的本质是一种慢性非特异性气道炎症，嗜酸性粒细胞和淋巴细胞是其主要的效应细胞，其中Th2细胞产生的IL-4和IL-5在炎症过程中发挥了关键作用[7]。

Bettiol等[8]发现哮喘患者外周血白细胞培养上清中IL-4和IL-5水平增高。

红霉素属大环内酯类抗生素，被认为具有抑制炎症递质产生及免疫调节作用，被作为当前防治哮喘有效的药物，而对其治疗哮喘的分子机制有了进一步的研究。

Asano[9]和Shinkai[10]等报道罗红霉素可以明显抑制抗原刺激后患者T淋巴细胞的增殖，并抑制IL-4和IL-5的分泌。

　　本实验结果显示哮喘组细胞上清液中IL-4和IL-5浓度较正常对照组显著升高，与Bettiol等[8]的研究结果相符;

而红霉素能显著抑制这种升高，与Asano