红霉素对哮喘大鼠外周血单个核细胞磷酸化JNK表达的影响Word文件下载.docx

1、探讨哮喘大鼠外周血单个核细胞（PBMCs） JNK磷酸化表达的变化及红霉素对其影响。方法：分离培养正常对照组、哮喘组、红霉素处理组大鼠的PBMCs。分别采用ELISA方法检测细胞上清液中IL-4，IL-5浓度，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、Western Bloting技术检测PBMCs JNKmRNA、磷酸化JNK的表达。结果：哮喘组PBMCs JNK磷酸化蛋白、mRNA表达水平及细胞上清液中IL-4，IL-5的浓度较正常对照组显著升高（P 0.05），红霉素处理组JNKmRNA、磷酸化蛋白表达水平及细胞上清液中IL-4，IL-5的浓度较哮喘组显著降低（P 0.05）。通过直线相关分析

2、发现，PBMCs JNK磷酸化蛋白与细胞上清液中IL-4，IL-5的表达水平之间均呈显著正相关（r分别为0.74和0.66，P均0.05）。结论：JNK可能参与支气管哮喘的病理生理过程。红霉素可能通过作用于JNK这一靶点发挥其抗炎效应。 【关键词】 支气管哮喘;外周血单个核细胞;JNK蛋白激酶;红霉素Abstract: Objective: To study the changes of the expression of JNK mitogen-activated protein kinase （JNK-MAPK） in peripheral blood mononuclear cells

3、（PBMCs） in rats with asthma and the effects of erythromycin on it. Methods: PBMCs were collected and cultured from rats with asthma，normal subjects and erythromycin-treated group. The levels of protein of IL-4，IL-5 in plasma， JNKmRNA and protein of JNK in PBMCs were detected with enzyme linked immun

4、osorbent assay （ELISA）， reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） and western bloting （WB）， respectively. Results: The expression of JNKmRNA、phosphor-JNK in PBMCs and the concentration of IL-4， IL-5 in supernatants were higher in asthmatic group than those in normal group （P 0.05）. By

5、 erythromycin treated，the above indexes were decreased signifi-cantly compared with those in asthmatic group （P 0.05）. There were positive correlations between the expression of phosphor-JNK and the concentration of IL-4，IL-5 in super-natants （r =0.74，0.66，P 0.05）. Conclusion: JNK may play a role in

6、 pathophysiological process of asthma. Erythromycin can effectively treat asthma through inhibiting the expression of p-JNK.Key words: asthma;peripheral blood mononuclear cells;JNK mitogen-activatedprotein kinase; erythromycin支气管哮喘是多种炎性细胞和细胞因子参与的气道慢性炎症。炎症学说的确立， 给哮喘的防治和研究带来了很大的进展。已有的研究发现， 淋巴细胞等炎症细胞及其

7、产生的多种细胞因子（IL-4和IL-5等）和炎症递质参与了哮喘的发病过程1。以红毒素、罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素等为代表的14环、15环大环内酯类抗生素对支气管哮喘有较好的治疗作用，可以改善哮喘患者的临床症状， 降低气道高反应性。然而其确切的作用机制尚未明确， 有文献表明，其抗哮喘作用可能与非抗菌性抗炎作用有关2-3。但有关红霉素对哮喘患者外周血单个核细胞（PBMCs）JNK表达的影响目前尚未见报道，本研究通过复制卵白蛋白（OVA）致敏的哮喘大鼠模型， 探讨红霉素对哮喘大鼠外周血单个核细胞JNK表达的影响。1 材料和方法1.1 材料 OVA（Sigma公司）;乳糖酸红霉素（大连美罗制药公司）

8、;磷酸化JNK和JNK多克隆抗体（Santa Cruz公司）;Western细胞裂解液、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗、 BCA蛋白定量试剂盒、PVDF膜（江苏碧云天生物技术研究所）;蛋白电泳转移系统（Bio-Rad公司）;IL-4和IL-5的ELISA试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）;Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司）;JNK和-actin引物（上海生工生物技术公司）。1.2 动物实验分组及模型复制 SPF级雄性SD大鼠30只，68周龄，体重250300 g（购自温州医学院实验动物中心）。随机分为正常对照组、哮喘组和红霉素处理组，每组10只。哮喘组及红霉素处理组动

9、物均复制哮喘模型：在第1、第8天腹腔注射1 mL OVA/Al（OH）3混合液内含OVA 1 mg和的Al（OH）3 100 mg致敏，致敏2周后开始应用空气压缩雾化器于密闭有机玻璃容器中以1%的OVA生理盐水溶液雾化激发，每次30 min，每周3次，共持续8周。正常对照组参照上述方法，只是致敏与激发时均以生理盐水代替。模型制备主要参考文献4。1.3 PBMCs分离、培养 无菌抽取肝素（30 U/mL）抗凝大鼠下腔静脉血5 mL，以淋巴细胞分离液分离PBMCs。离心洗涤后，用RPMI-1640培养基调细胞浓度为1106 /L，培养体系中加刺激物PHA 10g/mL，接种于6孔培养板内，相应分为

10、正常对照组、哮喘组和红霉素处理组（即加入终浓度为15g/mL的红霉素共同培养）。置于5% CO2、37 培养箱内培养48 h，收集细胞和细胞上清液备用，-70 保存。1.4 培养上清中IL-4和IL-5测定 采用ELISA法检测各组培养上清液中IL-4和IL-5的表达水平，操作按试剂盒说明书进行。1.5 PBMCs中JNK mRNA检测 JNK上游引物为：5-CCAGATTGGATATTTCCGTCAG-3，下游引物：5-TTCCCAGTCCATCACTTCG-3（产物片段长度为277 bp）;-actin上游引物为5-TCAGGTC ATCACTATCGGCAAT-3;下游引物为：5-AAA

11、GAAA GGGTGTAAAACGCA-3（产物片段长度为412 bp）。用Invitrogen公司的Trizol试剂盒，按说明书介绍的方法提取总RNA，按Takara公司说明书的操作步骤逆转录合成cDNA。PCR循环条件为：94 预变性5 min，94 变性30 s，不同退火温度（JNK 55 ，-actin 58 ）退火30 s，72 延伸1 min，共35个循环;循环结束后继续于72 内延伸5 min，于-20 保存备用。反应产物在1.5%琼脂糖中进行电泳，以-actin为内参照，采用Quantity One软件对各电泳条带的光密度进行半定量分析。1.6 PBMCs中JNK蛋白水平的检测

12、 采用蛋白免疫印迹法从6孔培养板中提取PBMCs，用Western细胞裂解液抽提PBMCs的全细胞蛋白样品，并经BCA法测定蛋白质浓度，煮沸变性后以30g/孔上样经4%积层胶后于10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）胶上电泳分离后转移至PVDF（聚偏氟乙烯）膜上;50 g/L脱脂牛奶封闭4 h，以适当比例稀释的抗JNK一抗孵育 4 过夜后洗脱，适当比例稀释的辣根过氧酶标记的二抗于室温1 h孵育、洗脱后采用BeyoECL Plus试剂进行化学发光法显色，之后曝光显影。采用美国BIO-RAD公司Quantity One分析软件对显影条带进行灰度分析，将目的蛋白与- actin

13、灰度比值作为目的蛋白的相对表达水平。1.7 统计学处理方法 组间比较采用方差分析。两变量之间的相关程度采用直线相关分析。2 结果2.1 各组培养上清液中IL-4以及IL-5的浓度差异 用ELISA方法检测哮喘组细胞上清液中IL-4、IL-5的浓度较正常对照组显著升高（P 0.05）， 红霉素处理组细胞上清液中IL-4以及IL-5的浓度较哮喘组显著降低（P 0.05）（见表1）。2.2 JNK基因表达结果 逆转录PCR结果显示，哮喘组PBMCs JNKmRNA表达水平较正常对照组显著升高（P 0.05），红霉素处理组JNKmRNA表达水平较哮喘组显著降低（P 0.05）（见表2及图1）。2.3

14、蛋白质印迹法结果 哮喘组PBMCs磷酸化JNK蛋白表达水平较正常对照组显著升高（P0.05），红霉素处理组磷酸化JNK蛋白表达水平较哮喘组显著降低（P0.05）。见表2和图2。2.4 PBMCs磷酸化JNK蛋白表达和培养上清液中IL-4和IL-5蛋白质含量之间的相关分析 通过直线相关分析发现，PBMCs磷酸化JNK蛋白表达与培养上清液中IL-4和IL-5蛋白质含量之间均呈显著正相关（r分别为0.74和0.66，P均0.05）。3 讨论丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）作为真核细胞转导细胞外信号到细胞内的四大信号系统之一，在信号转导过

15、程中发挥重要作用。作为MAPK家族信号系统一员的JNK，是重要的细胞信号分子之一，经上游激酶激活后由胞质移位至胞核，活化包括转录因子在内的多种效应蛋白，参与细胞增殖和凋亡的调节5。Wuyts等6研究显示JNK通道参与哮喘发病机制过程，并涉及哮喘气道慢性炎症、气道高反应性等多个方面。本实验结果显示JNK mRNA、磷酸化蛋白表达水平较正常对照组显著升高，提示JNK通道参与哮喘发病机制过程，与Wuyts等6的研究结果相符。本实验结果同时显示JNK在基因、蛋白水平均参与哮喘的发病过程。 目前认为哮喘的本质是一种慢性非特异性气道炎症，嗜酸性粒细胞和淋巴细胞是其主要的效应细胞，其中Th2细胞产生的IL-4和IL-5在炎症过程中发挥了关键作用7。Bettiol等8发现哮喘患者外周血白细胞培养上清中IL-4和IL-5水平增高。红霉素属大环内酯类抗生素，被认为具有抑制炎症递质产生及免疫调节作用，被作为当前防治哮喘有效的药物，而对其治疗哮喘的分子机制有了进一步的研究。Asano9和Shinkai10等报道罗红霉素可以明显抑制抗原刺激后患者T淋巴细胞的增殖，并抑制IL-4和IL-5的分泌。本实验结果显示哮喘组细胞上清液中IL-4和IL-5浓度较正常对照组显著升高，与Bettiol等8的研究结果相符;而红霉素能显著抑制这种升高，与Asano