实时荧光定量PCR具体实验步骤.docx

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实时荧光定量PCR具体实验步骤

实时荧光定量PCR具体实验步骤

实时荧光定量PCR操作步骤

以下实验步骤仅供参考：

1样品RNA的抽提

①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。

手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。

4℃下12000rpm离心15分钟。

离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。

RNA全部被分配于水相中。

水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。

加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟。

此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。

混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

2RNA质量检测

1）紫外吸收法测定

先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。

然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:

100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。

①浓度测定

A260下读值为1表示40µgRNA/ml。

样品RNA浓度（µg/ml）计算公式为：

A260×稀释倍数×40µg/ml。

具体计算如下：

RNA溶于40µlDEPC水中，取5ul，1:

100稀释至495µl的TE中，测得A260=0.21

RNA浓度=0.21×100×40µg/ml=840µg/ml或0.84µg/µl

取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35µl，剩余RNA总量为：

35µl×0.84µg/µl=29.4µg

②纯度检测

RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。

2）变性琼脂糖凝胶电泳测定

①制胶

1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10ml的10×MOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液（12.3M）。

10×MOPS电泳缓冲液

浓度  成分

0.4M  MOPS，pH7.0

0.1M  乙酸钠

0.01M  EDTA

灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25µl溶液。

胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

②准备RNA样品

取3µgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10µg/ml。

加热至70℃孵育15分钟使样品变性。

③电泳

上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。

5–6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。

④紫外透射光下观察并拍照

28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。

还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。

在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。

RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。

用数码照相机拍下电泳结果。

3样品cDNA合成

①反应体系

序号  反应物  剂量

1  逆转录buffer  2μl

2  上游引物  0.2μl

3  下游引物  0.2μl

4  dNTP  0.1μl

5  逆转录酶MMLV  0.5μl

6  DEPC水  5μl

7  RNA模版  2μl

8  总体积  10μl

轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

②混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。

③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。

4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR

①β-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按10倍稀释（加水27μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。

②反应体系如下：

标准品反应体系

序号  反应物  剂量

1  SYBRGreen1染料  10μl

2  阳性模板上游引物F  0.5μl

3  阳性模板下游引物R  0.5μl

4  dNTP  0.5μl

5  Taq酶  1μl

6  阳性模板DNA  5μl

7  ddH2O  32.5μl

8  总体积  50μl

轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

管家基因反应体系：

序号  反应物  剂量

1  SYBRGreen1染料  10μl

2  内参照上游引物F  0.5μl

3  内参照下游引物R  0.5μl

4  dNTP  0.5μl

5  Taq酶  1μl

6  待测样品cDNA  5μl

7  ddH2O  32.5μl

8  总体积  50μl

轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：

93℃　2分钟，然后93℃1分钟，55℃2分钟，共40个循环。

5制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板

①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。

反应体系：

序号  反应物  剂量

1  10×PCR缓冲液  2.5ul

2  MgCl2溶液  1.5ul

3  上游引物F  0.5ul

4  下游引物R  0.5ul

5  dNTP混合液  3ul

6  Taq聚合酶  1ul

7  cDNA  1ul

8  加水至总体积为  25ul

轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）；72ºC延伸5分钟。

②PCR产物与DNALadder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

③将PCR产物进行10倍梯度稀释:

将PCR产物进行10倍梯度稀释:

设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。

6待测样品的待测基因实时定量PCR

①所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。

体系配置如下：

序号  反应物  剂量

1  SYBRGreen1染料  10ul

2  上游引物  1ul

3  下游引物  1ul

4  dNTP  1ul

5  Taq聚合酶  2ul

6  待测样品cDNA  5ul

7  ddH2O  30ul

8  总体积  50ul

轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

②将配制好的PCR反应溶液置于RealtimePCR仪上进行PCR扩增反应。

反应条件为：

93℃2分钟预变性，然后按93℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。

7实时定量PCR使用引物列表

引物设计软件：

PrimerPremier5.0，并遵循以下原则：

引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。

8电泳

各样品的目的基因和管家基因分别进行RealtimePCR反应。

PCR产物与DNALadder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView™染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

实时荧光定量PCR

组织RNA提取：

一般认为100mg肝组织提取RNA500ng，100mg肺提取RNA200ng，脑内的RNA丰度适中，100mg脑组织，提取RNA5-200ng。

所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。

反转录反应

反转录反应参照TaKaRaRT-PCR说明书。

反转录反应条件如下。

37°C15min（反转录反应）

85°C5sec（反转录酶的失活反应）

RealTimePCR反应

选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因，核糖体18SrRNA（18SrRNA）做为内参。

基因

引物序列

扩增片段长度

NR2B

NR2B（+）

CCGCAGCACTATTGAGAACA

213bp

NR2B（–）

ATCCATGTGTAGCCGTAGCC

18srRNA

18srRNA（+）

tttgttggttttcggaactga

198bp

18srRNA（–）

cgtttatggtcggaactacga

1）按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

试剂

使用量

终浓度

SYBR®PremixExTaqTM（2×）

12.5μl

1×

其他值得注意的条件：

1建议使用0.2-ml薄壁管。

厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。

2最佳反应体积为50ml，推荐用30ml矿物油覆盖（对盖子加热的PCR仪可以不加）。

3大多数反应中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。

4建议使用1.75mmol/LMgCl2∶350mmol/LdNTP或2.25mmol/LMgCl2∶500mmol/LdNTP组合的混合物。

然而要得到最佳结果，优化Mg2+的浓度是必需的。

5基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应。

因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的长度。

DNA片段长度可以超过50kb，传统的基因组DNA能扩增片段至10kb。

6要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA。

请查阅高分子量DNA提取操作过程相关文献。

7降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。

进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。

使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。

这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。

8变性：

第一步变性在94℃下进行2分钟。

在循环过程中尽可能缩短变性时间（94℃下进行20--30秒），除非模板中富含GC，则95℃下变性30秒。

这可以防止DNA脱嘌啉和链断裂，对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12kb时，应该尽可能的降低变性温度。

9延伸：

68--72℃下进行延伸操作。

10循环延伸：

尽量采用循环延伸的条件，若PCR仪无此功能，则必须增加延伸的时间，例如在扩增10kb片断时，延伸时间用10分钟替代原来的8分钟。

11长片断PCR系统扩增的片断其3’-末端带有一个突出的A，因此建议采用T/A克隆。

若要进行平端可隆，可用Klenow酶和T4DNA多聚酶将PCR产物补平后再进行。

12测序时因酶的混合物带有3’→5’外切酶活性，用Sanger方法进行测序不能产生均一的（染色体）带型。

13在无菌的0.5ml或0.2ml离心管中按下列操作程序加样：

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