实时荧光定量PCR具体实验步骤.docx

1、实时荧光定量PCR具体实验步骤实时荧光定量PCR具体实验步骤实时荧光定量PCR操作步骤以下实验步骤仅供参考：1 样品RNA的抽提取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30孵育2到3分钟。4下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30

2、孵育10分钟后，于4下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4下7000rpm离心5分钟。 RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40l用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80待用。2 RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释

3、（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。 浓度测定A260下读值为1表示40 g RNA/ml。样品RNA浓度(g/ml)计算公式为：A260 稀释倍数 40 g/ml。具体计算如下：RNA溶于40 l DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495l的TE中，测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 100 40 g/ml = 840 g/ml 或 0.84 g/l 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 l，剩余RNA总量为：35 l 0.84 g/l = 29.4 g纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为R

4、NA纯度，比值范围1.8到2.1。2）变性琼脂糖凝胶电泳测定制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60，10 ml的10 MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。10MOPS电泳缓冲液浓度成分 0.4MMOPS，pH 7.00.1M乙酸钠0.01MEDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 l溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。准备RNA样品取3gRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10g/ml。加热至70孵育15分钟使样品变性。电泳上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样

5、孔。56V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少23cm。紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。3样品cDNA合成反应体系序

6、号反应物剂量1逆转录buffer2l2上游引物0.2l3下游引物0.2l4dNTP0.1l5逆转录酶MMLV0.5l6DEPC水5l7RNA模版2l8总体积10l轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5l，37水浴60分钟。取出后立即95干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80待用。4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（-actin）实时定量PCR -actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3l按10倍稀释（加水27l并充分混匀）为101

7、0，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。反应体系如下：标准品反应体系序号反应物剂量1 SYBR Green 1 染料10l2阳性模板上游引物F0.5l3阳性模板下游引物R0.5l4dNTP0.5l5Taq酶1l6阳性模板DNA5l7ddH2O32.5l8总体积50l轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。管家基因反应体系：序号反应物剂量1SYBR Green 1 染料10l2内参照上游引物F0.5l3内参照下游引物R0.5l4dNTP0.5l5Taq酶1l6待测样品cDNA5l7ddH2O32.5l8总体积50l轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。制备

8、好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：932分钟，然后93 1分钟，55 2分钟，共40个循环。5 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。反应体系：序号反应物剂量110 PCR缓冲液2.5 ul2MgCl2 溶液1.5 ul3上游引物F0.5 ul4下游引物R0.5 ul5dNTP混合液3 ul6Taq聚合酶1 ul7cDNA1 ul8加水至总体积为25ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。35个PCR循环（941分钟；551分钟；721分钟）； 72C延伸5分钟。PCR产物与 DNA Ladder在

9、2琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为11010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。6 待测样品的待测基因实时定量PCR 所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。体系配置如下：序号反应物剂量1SYBR Green 1 染料 10 ul2上游引物1ul3下游引物1ul4dNTP 1ul5Taq聚合酶2ul6待测样品cDNA5ul7ddH2O 30ul8总体积50 ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。将配制好的PCR反应

10、溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：932分钟预变性，然后按93 1分钟，551分钟，721分钟，共40做个循环，最后727分钟延伸。7 实时定量PCR使用引物列表引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。8 电泳各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。实时荧光定量PCR组

11、织RNA提取：一般认为100mg肝组织提取RNA 500ng，100mg肺提取RNA 200ng，脑内的RNA丰度适中，100mg脑组织，提取RNA 5-200ng。所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。反转录反应 反转录反应参照TaKaRa RT-PCR说明书。反转录反应条件如下。 37C 15 min（反转录反应） 85C 5 sec（反转录酶的失活反应） Real Time PCR反应 选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因，核糖体18S rRNA(18S rRNA)做为内参。基因引物序列扩增片段长度NR2BNR2B(+)CCGCAGCACTATTGAGAACA213 bp

12、NR2B()ATCCATGTGTAGCCGTAGCC18s rRNA18s rRNA(+)tttgttggttttcggaactga198 bp18s rRNA()cgtttatggtcggaactacga1） 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。 试剂 使用量 终浓度 SYBR Premix Ex TaqTM（2） 12.5 l1 其他值得注意的条件：1建议使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92时不能有效地使模板变性。2最佳反应体积为50ml，推荐用30ml矿物油覆盖（对盖子加热的PCR仪可以不加）。3大多数反应中，0.75ml（0.51ml）的酶量在大多数情况下可以得到满意

13、的结果。4建议使用1.75mmol/L MgCl2350mmol/L dNTP或2.25mmol/L MgCl2500mmol/L dNTP组合的混合物。然而要得到最佳结果，优化Mg2+的浓度是必需的。5基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的长度。DNA片段长度可以超过50kb，传统的基因组DNA能扩增片段至10kb。6要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA。请查阅高分子量DNA提取操作过程相关文献。7降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为2434个核苷酸，溶点在6068间。使用这类引物可提高PCR反应的退

14、火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。8变性：第一步变性在94下进行2分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间（94下进行20-30秒），除非模板中富含GC，则95下变性30秒。这可以防止DNA脱嘌啉和链断裂，对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12 kb时，应该尽可能的降低变性温度。9延伸：68-72下进行延伸操作。10循环延伸：尽量采用循环延伸的条件，若PCR仪无此功能，则必须增加延伸的时间，例如在扩增10kb片断时，延伸时间用10分钟替代原来的8分钟。11长片断PCR系统扩增的片断其3-末端带有一个突出的A，因此建议采用T/A克隆。若要进行平端可隆，可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶将PCR产物补平后再进行。12测序时因酶的混合物带有35外切酶活性，用Sanger方法进行测序不能产生均一的（染色体）带型。13在无菌的0.5ml或0.2ml离心管中按下列操作程序加样：1