1、实时荧光定量PCR具体实验步骤实时荧光定量PCR具体实验步骤实时荧光定量PCR操作步骤以下实验步骤仅供参考:1 样品RNA的抽提取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30孵育2到3分钟。4下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30
2、孵育10分钟后,于4下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。RNA清洗 移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4下7000rpm离心5分钟。 RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 溶解RNA沉淀 溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40l用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80待用。2 RNA质量检测1)紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释
3、(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液 浓度和纯度。 浓度测定A260下读值为1表示40 g RNA/ml。样品RNA浓度(g/ml)计算公式为:A260 稀释倍数 40 g/ml。具体计算如下:RNA溶于40 l DEPC水中,取5ul,1:100稀释至495l的TE中,测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 100 40 g/ml = 840 g/ml 或 0.84 g/l 取5ul用来测量以后,剩余样品RNA为35 l,剩余RNA总量为:35 l 0.84 g/l = 29.4 g纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为R
4、NA纯度,比值范围1.8到2.1。2)变性琼脂糖凝胶电泳测定制胶1g琼脂糖溶于72ml水中,冷却至60,10 ml的10 MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。10MOPS电泳缓冲液浓度成分 0.4MMOPS,pH 7.00.1M乙酸钠0.01MEDTA灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25 l溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的1MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。准备RNA样品取3gRNA,加3倍体积的甲醛上样染液,加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10g/ml。加热至70孵育15分钟使样品变性。电泳上样前凝胶须预电泳5min,随后将样品加入上样
5、孔。56V/cm电压下2h,电泳至溴酚兰指示剂进胶至少23cm。紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型),上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质,可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染,将会在28S核糖体RNA带的上面出现,即更高分子量的弥散迁移物质或者带,RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。3样品cDNA合成反应体系序
6、号反应物剂量1逆转录buffer2l2上游引物0.2l3下游引物0.2l4dNTP0.1l5逆转录酶MMLV0.5l6DEPC水5l7RNA模版2l8总体积10l轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70干浴3分钟,取出后立即冰水浴至管内外温度一致,然后加逆转录酶0.5l,37水浴60分钟。取出后立即95干浴3分钟,得到逆转录终溶液即为cDNA溶液,保存于-80待用。4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因(-actin)实时定量PCR -actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011,反应前取3l按10倍稀释(加水27l并充分混匀)为101
7、0,依次稀释至109、108、107、106、105、104,以备用。反应体系如下:标准品反应体系序号反应物剂量1 SYBR Green 1 染料10l2阳性模板上游引物F0.5l3阳性模板下游引物R0.5l4dNTP0.5l5Taq酶1l6阳性模板DNA5l7ddH2O32.5l8总体积50l轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。管家基因反应体系:序号反应物剂量1SYBR Green 1 染料10l2内参照上游引物F0.5l3内参照下游引物R0.5l4dNTP0.5l5Taq酶1l6待测样品cDNA5l7ddH2O32.5l8总体积50l轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。制备
8、好的阳性标准品和检测样本同时上机,反应条件为:932分钟,然后93 1分钟,55 2分钟,共40个循环。5 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板针对每一需要测量的基因,选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。反应体系:序号反应物剂量110 PCR缓冲液2.5 ul2MgCl2 溶液1.5 ul3上游引物F0.5 ul4下游引物R0.5 ul5dNTP混合液3 ul6Taq聚合酶1 ul7cDNA1 ul8加水至总体积为25ul轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。35个PCR循环(941分钟;551分钟;721分钟); 72C延伸5分钟。PCR产物与 DNA Ladder在
9、2琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为11010,依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。6 待测样品的待测基因实时定量PCR 所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。体系配置如下:序号反应物剂量1SYBR Green 1 染料 10 ul2上游引物1ul3下游引物1ul4dNTP 1ul5Taq聚合酶2ul6待测样品cDNA5ul7ddH2O 30ul8总体积50 ul轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。将配制好的PCR反应
10、溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为:932分钟预变性,然后按93 1分钟,551分钟,721分钟,共40做个循环,最后727分钟延伸。7 实时定量PCR使用引物列表引物设计软件:Primer Premier 5.0,并遵循以下原则:引物与模板的序列紧密互补;引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构;引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。8 电泳各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2琼脂糖凝胶电泳,GoldView染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。实时荧光定量PCR组
11、织RNA提取:一般认为100mg肝组织提取RNA 500ng,100mg肺提取RNA 200ng,脑内的RNA丰度适中,100mg脑组织,提取RNA 5-200ng。所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。反转录反应 反转录反应参照TaKaRa RT-PCR说明书。反转录反应条件如下。 37C 15 min(反转录反应) 85C 5 sec(反转录酶的失活反应) Real Time PCR反应 选用脑源神经营养因子(BDNF)为目标基因,核糖体18S rRNA(18S rRNA)做为内参。基因引物序列扩增片段长度NR2BNR2B(+)CCGCAGCACTATTGAGAACA213 bp
12、NR2B()ATCCATGTGTAGCCGTAGCC18s rRNA18s rRNA(+)tttgttggttttcggaactga198 bp18s rRNA()cgtttatggtcggaactacga1) 按下列组份配制PCR反应液(反应液配制请在冰上进行)。 试剂 使用量 终浓度 SYBR Premix Ex TaqTM(2) 12.5 l1 其他值得注意的条件:1建议使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92时不能有效地使模板变性。2最佳反应体积为50ml,推荐用30ml矿物油覆盖(对盖子加热的PCR仪可以不加)。3大多数反应中,0.75ml(0.51ml)的酶量在大多数情况下可以得到满意
13、的结果。4建议使用1.75mmol/L MgCl2350mmol/L dNTP或2.25mmol/L MgCl2500mmol/L dNTP组合的混合物。然而要得到最佳结果,优化Mg2+的浓度是必需的。5基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的长度。DNA片段长度可以超过50kb,传统的基因组DNA能扩增片段至10kb。6要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA。请查阅高分子量DNA提取操作过程相关文献。7降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。进行长片段PCR扩增时,引物长度一般为2434个核苷酸,溶点在6068间。使用这类引物可提高PCR反应的退
14、火温度来增加反应的特异性。这点非常重要,长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。8变性:第一步变性在94下进行2分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间(94下进行20-30秒),除非模板中富含GC,则95下变性30秒。这可以防止DNA脱嘌啉和链断裂,对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12 kb时,应该尽可能的降低变性温度。9延伸:68-72下进行延伸操作。10循环延伸:尽量采用循环延伸的条件,若PCR仪无此功能,则必须增加延伸的时间,例如在扩增10kb片断时,延伸时间用10分钟替代原来的8分钟。11长片断PCR系统扩增的片断其3-末端带有一个突出的A,因此建议采用T/A克隆。若要进行平端可隆,可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶将PCR产物补平后再进行。12测序时因酶的混合物带有35外切酶活性,用Sanger方法进行测序不能产生均一的(染色体)带型。13在无菌的0.5ml或0.2ml离心管中按下列操作程序加样:1
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