12 基因工程的基本操作程序Word文档下载推荐.docx

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②的构建；

③将目的基因；

④目的基因的。

二、目的基因的获取

【问题情境】①什么是目的基因？

②获取目的基因的途径有哪些？

③获取目的基因的常用方法有哪些？

1、目的基因：

①来源：

可以从中分离出来，也可以用合成。

②概念：

主要是指符合人们需要的的基因，也可以是一些具有作用的因子。

③举例：

。

2、目的基因的获取方法

⑴从基因文库中获取目的基因

①基因文库：

将含有某种生物的许多DNA片段，导入的群体中通过克隆而储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。

②基因文库的种类：

基因组文库：

含有一种生物的基因。

部分基因文库：

含有一种生物的基因（如cDNA文库）。

结合P10“生物技术资料卡”比较基因组文库与部分基因文库（cDNA文库）

文库类型

cDNA文库

基因组文库

文库大小

基因中启动子

基因中内含子

基因多少

物种间的基因交流

③从基因文库中得到目的基因：

可以根据一些信息，如根据基因的、基因的、

基因在染色体上的、基因的转录产物，以及基因的表达产物等特性来获取目的基因。

【拓展资料】用DNA探针从基因文库中准确提取目的基因

由于DNA双链的核苷酸序列是彼此互补的，当DNA分子杂交时，首先将双链DNA加热或提高pH，使双链解开（该过程称为变性，相反过程称之为复性），根据所需基因的核苷酸序列制成一段与之互补的核苷酸短链，并用同位素标记，即成为探针。

用这一探针探查基因文库中已经变性的DNA片段，如果有一个DNA片段能和探针片段互补结合而成双链（分子杂交），这一片段即含有所需要的基因。

⑵利用PCR技术扩增目的基因

①PCR含义：

是的缩写，是一项在生物体外复制的核酸合成技术。

②原理：

利用DNA的原理。

③前提：

有一段已知核苷酸序列，以便根据这一序列合成。

④条件：

DNA模板、。

⑤扩增过程：

目的基因DNA受热变性后解链为，与单链相应互补

序列结合，在的作用下进行延伸，如此重复循环多次。

a.变性（℃）：

目的基因DNA受热变性后接连为单链

b.退火（℃）：

与单链相应互补序列结合

c.延伸（℃）：

在的作用下进行延伸

Taq聚合酶的特点是。

⑥结果：

每次循环后目的基因的量增加，即呈形式扩增。

⑦仪器：

【思考交流】PCR技术与DNA复制的比较：

PCR技术

DNA复制

相

同

点

原理

原料

条件

不

解旋方式

场所

酶

结果

⑶人工合成法

①适用对象：

，已知，可以通过DNA合成仪用化学的方法直接人工合成。

②合成方法：

和

【拓展】真核细胞的基因编码区含有不能表达的内含子，因此不能直接用于基因的扩增和表达。

获取真核细胞中的目的基因时，一般采用人工合成的方法。

人工合成目的基因的方法主要有两种。

一种是反转录法，主要用于分子质量较大而又不知其序列的基因，它是以基因的mRNA为模板，借助反转录酶合成碱基互补的的单链DNA（cDNA），然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA。

从而获取所需的基因。

反转录法的操作过程如下：

另一种方法是化学合成法，即依照某一蛋白质的氨基酸序列，通过密码子推算出其基因序列，然后直接合成目的基因。

化学合成法的操作过程如下：

反转录法的专一性强，目的基因不含内含子。

但操作过程麻烦，mRNA生存时间短，技术要求高。

化学合成法的专一性强，目的基因不含内含子，可合成自然界不存在的新基因。

目前，对许多复杂的、尚不知道核苷酸序列的基因不能用此法合成。

【思考交流】获取目的基因的方法比较

项目

从基因文库中获取

PCR技术扩增

人工合成法

优点

缺点

【特别提醒】提取目的基因的三种方法的应用情况

①如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通过构建基因文库的方法，即通过用受体菌储存并扩增目的基因后，从基因文库中去获取目的基因。

②如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比较小，可以通过DNA合成仪利用化学的方法人工合成。

③如果知道扩增目的基因及两端的核苷酸序列，而且基因又比较大，则可以通过PCR技术扩增目的基因。

三、基因表达载体的构建------基因工程的核心

【问题情境】①为什么要构建基因表达载体？

单独的DNA片段能不能稳定遗传？

②基因表达载体的构成包括哪些元件？

绘制基因表达载体的模式图？

③什么是启动子、终止子？

各有什么作用？

④基因工程的运载体是否必须要有标记基因？

⑤怎样才构建基因表达载体？

1、组成及各部分功能

⑴基因表达载体的组成：

+++等。

⑵各部分功能

①启动子：

位于基因的，是识别和结合的部位，驱动基因转录产生mRNA。

②终止子：

位于基因的，终止。

③标记基因：

受体细胞是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。

④目的基因：

外源DNA分子的有效片段。

一般能编码满足人们需要的特定的蛋白质。

2、基因表达载体的功能

①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以给下一代；

②使目的基因能够和发挥作用。

3、构建方法

由于受体细胞有动物、植物、微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建上也会有所差别。

用一定的切割质粒，使其出现一个切口，露出。

用切断目的基因，使其产生。

将切下的目的基因片段插入质粒的，再加入适量，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）

【附图】基因表达载体的构建过程示意图

目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程!

四、将目的基因导入受体细胞

【问题情境】①什么是转化？

②比较将目的基因导入受体细胞方法？

（一）转化：

目的基因进人受体细胞内，并在受体细胞内维持和的过程。

基因工程常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。

（二）导入的方法

1、将目的基因导入植物细胞

（1）农杆菌转化法

①农杆菌特点：

易感染植物和裸子植物，对大多数植物没有感染力；

农杆菌Ti质粒上的可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上。

②转化：

目的基因插人农杆菌→导入植物细胞→目的基因整合到植物细胞染色体上→目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。

（2）基因枪法

基因枪法：

是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，是将目的基因包裹在微小的金粒或钨粒表面，然后将微粒用基因枪高速射入到受体细胞或组织中。

也需要借助植物组织培养技术，成本较高。

（3）花粉管通道法

花粉管通道法：

在授粉后向子房注射（将含目的基因的溶液滴在柱头上活用含目的基因的溶液处理花粉粒）含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。

这是我国科学家独创的一种方法，该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。

是一种十分简便经济的方法，原则上适用于任何开花植物。

（我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的）

2．将目的基因导入动物细胞

（1）方法：

技术。

（2）操作程序：

目的基因表达载体→取卵（受精卵）→显微注射→注射了目的基因的受精卵移植到性动物的内发育→新性状动物。

3．将目的基因导人微生物细胞

（1）原核生物特点：

繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。

（2）大肠杆菌最常用的转化方法：

氯化钙法

处理细胞→细胞→表达载体与感受态细胞混合→细胞吸收DNA分子。

（三）目的基因导入受体细胞的方法比较

细胞类型

常用方法

受体细胞

转化过程

植物细胞

将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上→表达

动物细胞

将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→早期胚胎培养→胚胎移植→发育成为具有新性状的动物

微生物

用Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子

五、目的基因的检测与鉴定

【问题情境】①受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？

②目的基因的检测内容和方法的比较？

③试分析真核生物的基因导入细菌细胞后，不能正常发挥功效的可能原因有哪些？

④β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。

当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。

假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？

1．检测方法及内容

标记了的、抗原抗体杂交。

（2）内容

①检测转基因生物染色体的DNA是否插入。

②检测目的基因是否转录。

③检测目的基因是否翻译成。

2．鉴定：

有时还需要进行水平的鉴定，如：

抗虫性鉴定、抗病性鉴定等。

【小结】目的基因的检测与鉴定

类型

步骤

检测内容

方法

结果显示

分子检测

第一步

目的基因是否进入

杂交

（DNA和DNA之间）

是否成功显示出杂交带

第二步

目的基因是否转录出

技术

（DNA和mRNA之间）

第三步

目的基因是否翻译出

个体水平

鉴定

包括、的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；

基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。

【思考交流】

1、试分析真核生物的基因导入细菌细胞后，不能正常发挥功效的可能原因有哪些？

①被细菌体内的破坏。

②该基因指导合成的蛋白质不能在细菌体内正确和。

③细菌的RNA聚合酶不能识别的位点，致使不能启动转录。

④细菌细胞中没有切除内含子转录部分的酶。

2、β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。

（1）从小鼠中克隆出的编码序列（cDNA）。

（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的，另外加上抗四环素的基因，构建成一个。

（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有的培养基上培养大肠杆菌。

如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会；

如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明。

（4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取。

【拓展延伸】

（1）基因探针

基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列（DNA或RNA）。

基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把