12 基因工程的基本操作程序Word文档下载推荐.docx

1、 的构建；将目的基因 ；目的基因的 。二、目的基因的获取【问题情境】什么是目的基因？获取目的基因的途径有哪些？获取目的基因的常用方法有哪些？1、目的基因：来源：可以从 中分离出来，也可以用 合成。概念：主要是指符合人们需要的 的基因，也可以是一些具有 作用的因子。举例： 。2、目的基因的获取方法从基因文库中获取目的基因基因文库：将含有某种生物 的许多DNA片段，导入 的群体中通过克隆而储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。基因文库的种类： 基因组文库：含有一种生物的 基因。部分基因文库：含有一种生物的 基因（如cDNA文库）。结合P10“生物技术资料卡”比较基因组文库与部分基因文库（c

2、DNA文库）文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间的基因交流从基因文库中得到目的基因：可以根据一些信息，如根据基因的 、基因的 、基因在染色体上的 、基因的转录产物 ，以及基因的表达产物 等特性来获取目的基因。【拓展资料】用DNA探针从基因文库中准确提取目的基因由于DNA双链的核苷酸序列是彼此互补的，当DNA分子杂交时，首先将双链DNA加热或提高pH，使双链解开（该过程称为变性，相反过程称之为复性），根据所需基因的核苷酸序列制成一段与之互补的核苷酸短链，并用同位素标记，即成为探针。用这一探针探查基因文库中已经变性的DNA片段，如果有一个DNA片段能和探针片

3、段互补结合而成双链（分子杂交），这一片段即含有所需要的基因。利用PCR技术扩增目的基因PCR含义：是 的缩写，是一项在生物体外复制 的核酸合成技术。原理：利用DNA 的原理。前提：有一段已知 核苷酸序列，以便根据这一序列合成 。条件：DNA模板、 。扩增过程：目的基因DNA受热变性后解链为 ， 与单链相应互补序列结合，在 的作用下进行延伸，如此重复循环多次。a.变性（ ）：目的基因DNA受热变性后接连为单链b.退火（ ）： 与单链相应互补序列结合c.延伸（ ）：在 的作用下进行延伸Taq聚合酶的特点是 。结果：每次循环后目的基因的量增加 ，即呈 形式扩增。仪器：【思考交流】PCR技术与DNA复

4、制的比较：PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不解旋方式场所酶结果人工合成法适用对象： ， 已知，可以通过DNA合成仪用化学的方法直接人工合成。合成方法： 和 【拓展】真核细胞的基因编码区含有不能表达的内含子，因此不能直接用于基因的扩增和表达。获取真核细胞中的目的基因时，一般采用人工合成的方法。人工合成目的基因的方法主要有两种。一种是反转录法，主要用于分子质量较大而又不知其序列的基因，它是以基因的mRNA为模板，借助反转录酶合成碱基互补的的单链DNA（cDNA），然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA。从而获取所需的基因。反转录法的操作过程如下：另一种方法是化学合成法，即依照某一蛋白质的氨

5、基酸序列，通过密码子推算出其基因序列，然后直接合成目的基因。化学合成法的操作过程如下：反转录法的专一性强，目的基因不含内含子。但操作过程麻烦，mRNA生存时间短，技术要求高。化学合成法的专一性强，目的基因不含内含子，可合成自然界不存在的新基因。目前，对许多复杂的、尚不知道核苷酸序列的基因不能用此法合成。【思考交流】获取目的基因的方法比较项目从基因文库中获取PCR技术扩增人工合成法优点缺点【特别提醒】提取目的基因的三种方法的应用情况如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通过构建基因文库的方法，即通过用受体菌储存并扩增目的基因后，从基因文库中去获取目的基因。如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比较

6、小，可以通过DNA合成仪利用化学的方法人工合成。如果知道扩增目的基因及两端的核苷酸序列，而且基因又比较大，则可以通过PCR技术扩增目的基因。三、基因表达载体的构建-基因工程的核心【问题情境】为什么要构建基因表达载体？单独的DNA片段能不能稳定遗传？基因表达载体的构成包括哪些元件？绘制基因表达载体的模式图？什么是启动子、终止子？各有什么作用？基因工程的运载体是否必须要有标记基因？怎样才构建基因表达载体？1、组成及各部分功能基因表达载体的组成： + + + 等。各部分功能启动子：位于基因的 ，是 识别和结合的部位，驱动基因转录产生mRNA。终止子：位于基因的 ，终止 。标记基因： 受体细胞是否含有

7、目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。目的基因：外源DNA分子的有效片段。一般能编码满足人们需要的特定的蛋白质。2、基因表达载体的功能使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以 给下一代；使目的基因能够 和发挥作用。3、构建方法由于受体细胞有动物、植物、微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建上也会有所差别。用一定的 切割质粒，使其出现一个切口，露出 。用 切断目的基因，使其产生 。将切下的目的基因片段插入质粒的 ，再加入适量 ，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）【附图】基因表达载体的构建过程示意图目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程!四

8、、将目的基因导入受体细胞【问题情境】什么是转化？比较将目的基因导入受体细胞方法？（一）转化：目的基因进人受体细胞内，并在受体细胞内维持 和 的过程。基因工程常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。（二）导入的方法1、将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法 农杆菌特点：易感染 植物和裸子植物，对大多数 植物没有感染力；农杆菌Ti质粒上的 可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上。 转化：目的基因插人 农杆菌导入植物细胞目的基因整合到植物细胞染色体上目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。（2）基因枪法基因枪法：是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，是将目的基因包

9、裹在微小的金粒或钨粒表面，然后将微粒用基因枪高速射入到受体细胞或组织中。也需要借助植物组织培养技术，成本较高。（3）花粉管通道法花粉管通道法：在授粉后向子房注射（将含目的基因的溶液滴在柱头上活用含目的基因的溶液处理花粉粒）含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。这是我国科学家独创的一种方法，该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。是一种十分简便经济的方法，原则上适用于任何开花植物。（我国的转基因抗虫棉

10、就是用此种方法获得的）2将目的基因导入动物细胞（1）方法： 技术。（2）操作程序：目的基因表达载体 取卵（受精卵） 显微注射注射了目的基因的受精卵移植到 性动物的 内发育新性状动物。3将目的基因导人微生物细胞（1）原核生物特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。（2）大肠杆菌最常用的转化方法：氯化钙法 处理细胞 细胞表达载体与感受态细胞混合 细胞吸收DNA分子。（三）目的基因导入受体细胞的方法比较细胞类型常用方法受体细胞转化过程植物细胞将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上转入农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的DNA上表达动物细胞将含有目的基因的表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射早期胚胎培

11、养胚胎移植发育成为具有新性状的动物微生物用Ca2+处理细胞感受态细胞重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子五、目的基因的检测与鉴定【问题情境】受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？目的基因的检测内容和方法的比较？试分析真核生物的基因导入细菌细胞后，不能正常发挥功效的可能原因有哪些？-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？1检测方法及内容标记了的 、抗原抗体杂交。（2）内容检测转基因生物染色体的DNA是否插入 。检测目的基

12、因是否转录 。检测目的基因是否翻译成 。2鉴定：有时还需要进行 水平的鉴定，如：抗虫性鉴定、抗病性鉴定等。【小结】目的基因的检测与鉴定类型步骤检测内容方法结果显示分子检测第一步目的基因是否进入 杂交（DNA和DNA之间）是否成功显示出杂交带第二步目的基因是否转录出 技术（DNA和mRNA之间）第三步目的基因是否翻译出 个体水平鉴定包括 、 的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。【思考交流】1、试分析真核生物的基因导入细菌细胞后，不能正常发挥功效的可能原因有哪些？被细菌体内的 破坏。该基因指导合成的蛋白质不能在细菌体内正确 和 。细菌

13、的RNA聚合酶不能识别 的位点，致使不能启动转录。细菌细胞中没有切除内含子转录部分的酶。2、-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。（1）从小鼠中克隆出 的编码序列（cDNA）。（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的 ，另外加上抗四环素的基因，构建成一个 。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有 的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会 ；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明 。（4）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取 。【拓展延伸】（1）基因探针基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列（DNA或RNA）。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把