菌落总数检测中的注意要点Word文档下载推荐.docx
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（三）平板接种与培养
1．将稀释液加至灭菌平皿内时，应根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2—3个适宜稀释度，分别在作1O倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移lml稀释液加入皿内（从皿侧加入，不要揭去皿盖），最后将吸管直立使液体流毕，并在皿底干燥处再擦一下吸管尖将余液排出，而不要吹出。
每个稀释度应作2个平皿。
2．用于倾注平皿的营养琼脂应预先加热使融化，并保温于45±
1℃恒温水浴中待用。
倾注平皿时，每皿内倾入约1.5ml，最后将琼脂底部带有沉淀的部分弃去。
3.为了防止细菌增殖及产生片状菌落，在检液加入平皿后，应在20分钟内向皿内倾入琼脂，并立即使其与琼脂混和均匀。
4．检样与琼脂混和时，可将皿底在平面上先向一个方向旋转，然后再向相反的方向旋转，以使充分混匀。
旋转中应加小心，不要使混和物溅到皿边的上方。
为了保证混和均匀，而不溅及皿边的上方，可使用江苏省无锡县卫生防疫站童鹤泉设计制成的自动平皿旋转仪，直接将加有检样的平皿放在旋转仪上（可同时放4只平皿），加入琼脂后，开动电钮，在数十秒钟内即可自动左右旋转而使皿内的检样与琼脂混合均匀。
5．皿内琼脂凝固后，不要长久放置，然后始翻转培养；
而应于琼脂凝固后，在数分钟内即应将平皿翻转予以培养，这样可避免菌落蔓延生长。
必要时，可先将皿打开倒置（皿底向上）于温箱内经15~60分钟使琼脂表面干燥后，再将皿底移至盖内倒置于温箱内培养。
这样可以阻止运动性强的变形杆菌属、假单胞菌属和芽胞杆菌属中一些菌株在琼脂表面扩展生长。
6．为了控制污染，在取样进行检验的同时，于工作台上打开一块琼脂平板，其暴露的时间，应与该检样从制备、稀释到加入平皿时所暴露的最长的时间相当，然后与加有检样的平皿一并置于温箱内培养，以了解检样在检验操作过程中有l无受到来自空气的污染。
7．培养温度，应根据食品种类而定。
肉、，乳、蛋类食品用37℃培养，水产品用30℃培养。
培养时间为48±
2小时。
其他食品，如清凉饮料，调味品，糖果、糕点．果脯，酒类（主要为发酵酒）、豆制品和酱腌莱均系用37℃24±
2小时培养。
培养温度和时间之所以有这种不同的区分，乃是因为在制定这些食品卫生标准中关于菌落总数的规定时，分别采用了不同的温度和培养时间所取得的数据之故。
水产品因来自淡水或海水，水底温摩较低，因而制定水产品细菌方面的卫生标准时，系用30℃作为培养的温度。
（四）对照试验
1．加入平皿内的检样稀释液（特别是10_1的稀释液），有肘带有食品颗粒，在这种情况下，为了避免与细菌菌落发生混淆，可作一检样稀释液与琼脂混和的平皿，不经培养，而于4℃环境巾放置，以便在计数捡样菌落时用作对照。
2．为了防止检样中食品颗粒与菌落混淆，也可在已溶化而保温于45℃水浴内的琼脂中，按每100ml加lmlO．5％氯化三苯四氮唑（2，3，5triphenyltetrazoliumchloride，TTC）水溶液之量加入适量的TTC。
培养后，如系食品颗粒，不见变化，如为细菌，则生成红色菌落．配好的TTC溶液，应先用来与不加TTC的作对照，以观察其对计数是否有不利的作用（TTC在一定浓度下对革兰氏阳性菌有抑制作用）。
TTC溶液要放冷暗处保存，以防受热与光照而发生分解。
无色的TTC是作为受氢体加入培养基中，如果有细菌存在，培养后，在细菌脱氢酶的作用下，TTC便接受氢而成为红色的三苯基甲艏（formazan），使菌落呈现红色，其反应式如图2-I：
（五）菌落计数
1．从温箱内取出平皿进行菌落计数时，应先分别观察同一稀释度的两个平皿和不同稀释度的几个平皿内平板上菌落生长情况。
平行试验的2个平板与菌落数应该接近，不同稀释度的几个平板上菌落数则应与检样稀释倍数成反比，即检样稀释倍数越大，菌落数越低，稀释倍数越小，菌落数越高。
2．计数菌落时，应选取菌落数在30~300之间的平板作为菌落总数测定的标准。
1个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数；
如其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。
如在一个稀释度的两个平板中，一个平板的菌落数在30一300之间，另一个大于300或小于30时，则以菌落数在30—300间的平板作为计数的标准。
3．菌落计数所得结果，可分别按以下几种不同情况作报告。
（1）若1个稀释度的平均菌落数在30—300之间，则将该菌落数乘其稀释倍数报告之，如表2-1中例1，报告为164×
102=16400，或1．6×
104。
（2）若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30—300之间，则视二者之比如何来决定。
若其比值小于2，应报告其平均数，如表2-1中例2：
46000／29500=1．6<
2，故报告为：
（46000+29500）／2=37750或3．8×
lO4。
若大于2，则报告其中较小的数字，如表2-1中例3：
60000／27lOO=2.2>
27lOO或2．7×
若等于2，亦报告其中较小的数字，如表2-1中例4：
3000／1500=2，故报告为：
1500或1．5×
lO3．
（3）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之，如表2-1中例5，报告为：
313×
108=313000或3．1×
105。
（4）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀表2-1稀释度的选择及菌落数报告方式
稀释液及菌落数
例次
lO-1
10-2lO-3
两稀释液
之比
菌落总数
（个／g或m1）
报告方式
～
（个／g或m1）
l
2
3
4
56
7
8多不可计多不可计多不可计
150多不可计
27
O多不可计
164
295
271
30多不可计
1l
0
305
20
46
60
8
313
5
O12
一
1.6
2.2
一一
一
16400
37750
27100
1500
3l3000
270
‘
<
l×
10
30500
1,6000或1.6×
104
38000或3.8×
lO4
27000或2.7×
1500或1.5×
103
310000或3.1×
105
270或2.7×
lO。
lO
31000或3．I×
10‘
释倍数报告之，如表2-1中例6，报告为：
27×
10=270或2．7×
102。
（5）若所有稀释度均无菌落生长，则以小于l（<
1）乘以最低稀释倍数报告之，如表2-1中例7，报告为：
<
10，或<
（6）若所有稀释度的平均菌落数均不在30—300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之，如表2-1中例8，报告为：
305×
10。
=305或3．1×
4．注意事项
（1）如果稀释度大的平板上菌落数反比稀释度小的平板上菌落数高，则系检验工作中发生的差错，属实验室事故。
此外，也可能因抑菌剂混入样品中所致，均不可用作检样计数报告的依据。
（2）如果平板上出现链状菌落，菌落之间没有明显的界限，这是在琼脂与检样混合时，一个细菌块被分散所造成。
一条链作为一个菌落计，如有来源不同的几条链，每条链作为一个菌落计，不要把链上生长的各个菌落分开来数。
此外，如皿内琼脂凝固后未及时进行培养而遭受昆虫侵入，在昆虫爬过的地方也会出现链状菌落，也不应分开来数。
（3）如果所有平板上都有菌落密布，不要用多不可计作报告，而应在稀释度最大的平板上，任意数其中2cm2个，除2求出每cm2内平均菌落数乘以皿底面积63.6cm2数，再乘其稀释倍数作报告。
例如10-1～10-3稀释度的所有平板上均菌落密布，而在lO-3稀释的平板上任数2个cm2。
内的菌落数是60个，皿底直径为9cm，则该检样每g（或m1）中“估计”菌落数为：
60／2×
63．6×
1000=1908000或1．9×
106。
63.6cm2数系按皿底直径为9cm时计算而得，即：
（9／2）2×
3．14=63．6；
如所用平皿的皿底直径不是9cm，则可按其直径的实际cm数代人圆面积公式求出。
（4）菌落计数中，如能使用国产JLQ—S。
型菌落计数器（江苏武进郑陆医学仪器厂产品），则比较方便，灯光由侧面射向平板，菌落易于观察。
由于仪器带有电子音响讯号，用特制金属探笔点数中，在发出音响之下始显示数字增加，不会发生差错。
且灯光与平板之间夹有多用方格玻质规板（方格面积为lcm2），也有助于对菌落密布的平板进行计数。
（5）检样如系微生物类制剂（如酸牛乳、酵母制酸性饮料），则平板计数中应相应地将有关微生物（乳酸杆菌、酵母菌）排除，不可并入检样的菌落总数内作报告。
一般在校正检样的pH7．6后，再进行稀释和培养，此类嗜酸性微生物往往即不易生长。
并可用革兰氏法染色鉴别。
染色鉴别时，要用不校正pH的检样做成相同稀释度的稀释液培养所生成的菌落涂片染色作对照，以资辨别。
酵母菌卵圆形，远比细菌大，大小为2～5×
5～30μm，革兰氏阳性着色。
乳酸杆菌在24小时内，于普通营养琼脂平板上在有氧条件下培养，通常是不生长的。
（六）报告方式
1．当检样的菌落数为l一100时，按实有数报告；
大于100时，只记录左面头两位数字（用两位有效数字作报告，可避免产生虚假的精确概念），左面第三位数字则用四舍五入法计算，从第二位数字之后都记为o，为了缩短数字后面的0数，也可用10的指数来表示，例如菌落数为37750时，即可写成3．8×
l05（见表2-1中“报告方式”栏）。
2．检样的菌落数如系从菌落密布的平板上按比例计算而求得，报告结果时，应在菌落数前加上“估计”二字（见上述菌落计数注意事项“（3）”中所举之例）。
3．检样为固体，用重量法取样检验时，以g为单位报告其菌落数；
检样为液体，用容量法取样检验时，以ml为单位报告其菌落数；
如检样为样品表面的涂擦液，则应以cm2为单位报告其菌落数。
4．如检样为液体，在两个平皿内所加lml未经稀释的检样（原液）培养中，均无细菌集落生成，则报告为lml检样内未有菌落生长，或1m1检样内菌落数<
1。
五、特殊的方法
（一）平板表面涂布法
．
将营养琼脂制成平板，经50℃l一2小时或35℃18—20小时干燥后，于其上滴加检样稀释液0．2ml
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