内毒素凝胶法检查技术PPT文档格式.ppt

内毒素凝胶法检查技术PPT文档格式.ppt

《内毒素凝胶法检查技术PPT文档格式.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《内毒素凝胶法检查技术PPT文档格式.ppt（50页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

用精确移液器准确吸取0.1mlBET水分别加入每支鲎试剂中，使鲎试剂全部溶解,阴性对照溶液D,0.06EU/ml,0.125EU/ml,0.25EU/ml,0.5EU/ml,2022/10/14,.,Page13,3）加样,用精确移液器分别吸取0.1ml的0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml的标准内毒素溶液C，加入复溶的鲎试剂中，每浓度平行4管，吸取0.1mlBET水（D溶液）加入另外两支鲎试剂内，作为阴性对照,CSE,TAL,0.1ml,0.5EU/ml,0.1ml,0.1ml,0.25EU/ml,0.1ml,0.1ml,0.125EU/ml,0.1ml,0.1ml,0.06EU/ml,0.1ml,0.1ml,BET水,0.1ml,加样顺序一般从低浓度到高浓度,2022/10/14,.,Page14,4）恒温反应,将加样完的鲎试剂混合液轻轻摇匀（避免产生气泡），放入371的恒温器中孵育602分钟（孵育过程中避免振动影响凝胶形成）若恒温装置是水浴恒温箱，那么在加样后需将反应管封口，避免水蒸气进入反应管内造成污染,2022/10/14,.,Page15,5）结果判断,将反应试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性，记录为“”；

未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为“-”。

阳性,阴性,结果判断：

反应管缓缓倒转180阳性（+）：

凝胶不变形，不从管壁滑脱者阴性（-）：

凝胶不能保持完整，从管壁滑脱者试验符合要求的基本条件：

NC管全部阴性（）2管全部阳性（）0.25管全部阴性（）,2022/10/14,.,Page16,6）数据处理举例,c=lg-1（X/4）=lg-1（0.903）（0.602）（0.602）（0.602）/4=0.210EU/ml即本批号鲎试剂的复核灵敏度（c）为0.21EU/ml药典要求：

当c在0.52（包括0.5和2）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度值。

结论：

本批TAL的灵敏度标示值符合规定。

2022/10/14,.,Page17,4、干扰初筛试验,目的及原理本试验是药品与鲎试剂相容性的筛选试验，通过对一系列含2内毒素浓度的样品溶液与鲎试剂的反应，初步筛选出对鲎试验无干扰的浓度本试验可减少干扰试验的盲目性,2022/10/14,.,Page18,试验步骤,供试品限值的确定供试品最大有效稀释倍数的确定试剂的选择反应溶液的制备加样及反应结果判断,2022/10/14,.,Page19,干扰初筛试验举例,1）供试品限值硫酸庆大霉素，100ml/瓶，20000U/ml；

药典要求，硫酸庆大霉素限值L=0.5EU/1000U,2022/10/14,.,Page20,2）最大有效稀释倍数的确定,最大有效稀释倍数MVD=cL/使用=0.5EU/ml灵敏度的鲎试剂时，MVD0.5=因此可计算出使用不同时所对应的MVD：

0.5EU/ml,20000U/ml0.5EU/1000U,=20（倍）,2022/10/14,.,Page21,3）试剂,为了方便试验，干扰初筛试验中一般选择灵敏度较低的鲎试剂作试验,2022/10/14,.,Page22,4）各反应溶液的制备,2022/10/14,.,Page23,溶液C的制备,E100,0.4ml,3.6mlW,E10,溶液C：

E2,溶液A的制备,S原液,0.4ml,3.6mlW,S10,溶液A,备用液,备用液,2022/10/14,.,Page24,溶液B的制备,溶液B：

SE2,注意事项：

制备溶液C和B时，每一步的混合液需在旋涡混合器上混合至少30秒。

2022/10/14,.,Page25,5）加样及反应,开启20支鲎试剂，分别用移液器准确吸取0.1mlBET水将鲎试剂复溶取0.1ml相应溶液C、B、A加入鲎试剂反应管，每浓度平行2管另外取0.1mlBET水作为阴性对照溶液D加入鲎试剂反应管。

2022/10/14,.,Page26,6）结果判断,当溶液A、D均为阴性；

溶液C均为阳性时，试验有效溶液B系列中，第一个出现阳性结果的浓度即初步将其判断为样品的无干扰浓度。

本试验中的样品无干扰浓度为S40,2022/10/14,.,Page27,5、干扰试验,通过比较鲎试剂与内毒素在水溶液和供试品溶液中反应的差异程度，来确定供试品在该浓度下是否对BET检查有干扰。

至少对3批样品进行干扰试验。

2022/10/14,.,Page28,试验步骤,供试品限值的确定鲎试剂的选择最大有效稀释倍数的确定反应溶液的制备加样及反应结果判断,2022/10/14,.,Page29,1）供试品限值,硫酸庆大霉素，20000U/ml；

药典要求内毒素限值L=0.5EU/1000U,2）试剂的选择,根据干扰初筛试验的结果，供试品在40倍稀释（对应鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml）时无干扰一般不选择第一个出现阳性结果的供试品浓度作干扰试验。

这里我们选择灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行干扰验证试验。

2022/10/14,.,Page30,3）最大有效稀释倍数的计算,MVD=cL/=80（倍）,4）各反应溶液的制备,2022/10/14,.,Page31,溶液C的制备,CSE（E4）、E2、E、E0.5、E0.25（即E0.5、E0.5、E0.125、E0.06、E0.03）,溶液C,混合5分钟,2022/10/14,.,Page32,溶液A的制备,S原液,0.3ml,2.7mlW,S10,硫酸庆大霉素,S,0.3ml,S10,2.7ml,1.0ml,3.0ml,溶液A：

S80,BET水,0.6ml,0.6ml,S40,2022/10/14,.,Page33,溶液B的制备,2022/10/14,.,Page34,5）加样及反应,开启36支鲎试剂，先分别用0.1mlBET水复溶,再分别加相应的溶液0.1ml（A、B、C和D）371反应602分钟,0.25EU/ml

（2）,0.125EU/ml（）,0.06EU/ml（）,0.03EU/ml（）,BET水,S80E0.25（SE2）,S80E0.125（SE）,S80E0.06（SE）,S80E0.03（SE）,S80,2022/10/14,.,Page35,6）结果判断,反应结果,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,2022/10/14,.,Page36,结果计算及判断,药典规定：

当溶液A和溶液D（阴性对照）的所有平行管都为阴性，且0.5Es2时，试验有效。

当0.5EsEt2Es时，供试品在该浓度下无干扰。

本试验：

1）0.5=0.06，2=0.25Es=0.125，0.5Es2，有效!

2）0.5Es=0.06，2Es=0.25Et=0.104，0.5EsEt2Es，无干扰！

使用灵敏度=0.125EU/ml的鲎试剂对样品（S）的80倍稀释液（S80）作BET，无干扰。

ES=lg-1,4,（lg0.125）4,=0.125EU/ml,Et=lg-1,=0.104EU/ml,（lg0.06）+（lg0.125）3,4,2022/10/14,.,Page37,6、检查法,1）凝胶法限量试验反应项目设置,2022/10/14,.,Page38,试剂,根据干扰试验结果，供试品在80倍稀释，使用鲎试剂灵敏度为0.125EU/ml条件下，对BET无干扰本试验选择TAL灵敏度为0.125EU/ml，供试品稀释80倍检查,2022/10/14,.,Page39,各反应溶液制备,溶液C,溶液A,溶液B,2022/10/14,.,Page40,加样及反应,开启8支鲎试剂，分别加0.1mlBET水复溶；

再分别加入相应的溶液，每浓度平行2管,溶液D（W）,溶液C（E0.25）,溶液A（S80）,溶液B（S80E0.25）,各0.1mL,各0.1mL,各0.1mL,各0.1mL,2022/10/14,.,Page41,结果判断,当需要复检时，A溶液平行4管，若所有平行管均为阴性，则供试品合格；

否则不合格。

+,2022/10/14,.,Page42,2）凝胶法半定量试验,注：

A为不超过MVD并且通过干扰实验的供试品溶液，从通过干扰试验的稀释倍数开始用检查用水稀释成1倍，2倍，4倍，8倍，最后的稀释倍数不得超过MVD。

B为2浓度标准内毒素的溶液A（供试品阳性对照）C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列D为阴性对照,反应项目设置,2022/10/14,.,Page43,凝胶半定量试验举例,试剂,凝胶半定量法一般选用灵敏度较高的鲎试剂,2022/10/14,.,Page44,各反应溶液的制备,溶液C的制备将CSE稀释成E0.125,E0.06,E0.03,E0.015浓度溶液溶液A的制备将供试品（S1）稀释至2倍、4倍、8倍,E1.25,0.4ml,3.6mlW,2022/10/14,.,Page45,加样及反应,溶液B的制备,近似稀释法,2022/10/14,.,Page4