exosomes外泌体实验方案_精品文档文档格式.docx
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1.5快速地使用或置于-80℃中待用为检测外泌体的蛋白浓度,取2μL的样品置于卡上,用DirectDetect™(Millipore)
1
2材料
a)细胞培养液
b)蛋白酶抑制(Sigma)
c)过滤筛(Millipore)
d)冷的PBS
e)低粘附的管
f)DirectDetect™(Millipore)
二、以超高速离心的方法来分离外泌体(人血浆)
1.1在提取外泌体之前应该向血浆里添加1;
500浓度比的蛋白酶抑制剂(Sigma)
1.2将上清液移至一个新的管中离心200*g20分钟4℃
1.3小心地再将上清液移至新的管中离心10000*g30分钟于4℃来去除较大的囊泡、
1.4此阶段的样品可以
1.5将样品用0.22μm的注射器滤筛(Millipore)过滤并且离心110000g(SorvallWXULTRASERIES,rotorF65L)2小时4℃
1.6用冷的PBS重悬后再次超速离心(110,000g,1h,4℃).,
1.7将外泌体小心干燥并且用冷的PBS重悬
1.8外泌体应该立即使用或-80摄氏度冷藏
2.材料
a)蛋白酶抑制(Sigma)
b)过滤筛(Millipore)
c)冷的PBS
d)低粘附的管
e)DirectDetect™(Millipore)
三、ExoQuickTM化学沉淀法
1.1ExoQuickTM的使用要按照厂家提供的说明书来实行
1.2该试剂盒可以简单地提取CM,人血浆,和血清里的外泌体,只需用倒相管按照所指示的量来加入ExoQuickTM试剂盒里的溶液
1.3溶液孵化过夜,在4℃温和的摇晃
1.4在流式细胞仪缓冲液中洗涤
1.5试剂盒里的带荧光的免疫磁珠已经被绑定,用流式细胞仪鉴定即可(BDBiosciences)配合使用CellQuest的软件。
a)ExoQuickTM试剂盒
b)流式细胞仪
四、用METM分离外泌体
1.1样品(CM或人血清)要按照商品说明书(NewEnglandPeptide–NEP)稀释
1.2样品要事先处理好,17,000g7分钟来去除微粒物质
1.3然后用METM试剂来孵化样品(NEPpeptide)并且用旋转震荡在室温混合15分钟
1.4孵化完的样品要室温离心10000g7分钟
1.5所有的样品要用PBS洗三次
1.6最后小囊泡要用合适的KIT缓冲液重悬
五、抗体
以下的外泌体有关的一抗和二抗是用作:
WestenBlot,ELISA和FACS(流式细胞术)
1.1mAbaCD9,mAbaCD63,mAbaCD81,mAbaCD63-FITC,aCD81-PE,来自于BecktonDickinson,
1.2mAbaCD63-biotin(BioLegend),
1.3mAbaAlix(SantaCruz),
1.4mAbaTsg101(Abcam),
1.5pAbaRab5(SantaCruz),
1.6mrAbaRab5(Epitomics),
1.7mAbaCalnexin(Abcam),
1.8二抗是anti-Mouse和anti-RabbitHRP-conjugated(Dako).专门的肿瘤外泌体(HBM1andHBM2)结合抗体由HansaBioMedR&
Dteam.提供
六、用WestenBlot探测外泌体的蛋白
1.1将样品用合适容积的蛋白loadingBuffer(Lonza)重悬在合适的浓度下
1.2用SDS-page分离外泌体的蛋白质
1.3把蛋白转到硝酸纤维素膜上(GEHealthcare)
1.4一二抗体孵化
1.5信号要在暗室里用ECL附加
七、外泌体免疫捕捉和蛋白定量ELISA
1.1从已经加了不同抗体的96孔板(Nunc)里的细胞上清或者人血浆为免疫捕捉而筛选外泌体结合抗体(96孔板的抗体用碳酸氢盐缓冲液PH=9.6稀释,用0.5%BSA固定和1%的蔗糖稳定)
1.2PBS加入0.05%Tween-20(PBST)作为洗涤缓冲液,但如果有提示说明,应该用PBS稀释样品
1.3将外泌体样本,CM,人血浆样本加入96板孔内(最终容积为100μl),孵化4℃过夜或者室温2小时(可以使用商业化的exosomes捕捉平板(HansaBioMed))
1.4传统上的protocol包含使用主要的抗体(aCD9或aCD63)在样品缓冲液(0.5%BSAPBS)中稀释2小时于4℃。
1.5在大量的冲洗后,用辣根过氧化物酶二抗(BioRad),在需要的地方用样品缓冲液1小时于4℃。
基于BMBluePODSubstrate辣根过氧化物酶的底物(Roche)反应的光密度反应,在450nm的酶标仪下记录Infinite_M1000(TECAN)
a)QuantaBluFluorogenicPeroxidaseSubstrate(ThermoScientific)要用连续的激发光束在325/425nm
b)SuperSignalWestFemtoChemiluminescentSubstrate(ThermoScientific)要先孵化1分钟然后在酶标仪化学发光模式读数
a)96孔板
b)碳酸氢盐缓冲液PH=9.6
c)BSAPBSTween-20蔗糖
d)辣根过氧化物酶二抗
e)辣根过氧化物酶的底物
f)酶标仪
八、磁珠捕获外泌体
1.商业化的预包裹的乳胶微球
1.1根据商品说明书(HansaBioMed)来分离外泌体
1.2每个样品先用1ml的PBS来稀释
1.3选用合适的珠子去孵化4℃过夜,旋转震荡。
1.4之后可以用离心的方法来分离(5000个,10分钟),再用PBST洗涤3次。
2.磁珠分离法
2.1比较了“1μm大小的链霉亲和素磁珠”(ThermoScientific,88816)和“亚显微大小的超磁力珠”(内部订购)
2.2先用PBST洗涤磁珠然后加入1.2μg的抗体(外泌体结合的同种抗体,CD9抗体(BecktonDickinson))
2.3生物素化的抗体用于链霉亲和素磁珠,然后用PBST洗三次,再用合适的固定剂固定(干酪素,BSA或人血清)室温1小时
2.4重悬于PBS,然后加入样品(CM或人血浆)
2.5为了最终可以富集磁珠到近108/ml,将其孵化过夜4摄氏度旋转rotation
2.6用电磁分离磁珠,在量化外泌体蛋白或提取外泌体RNA之前用PBST洗三次
2.7磁珠也会溶解于Laemmlibuffer,所以在做为westenbolt先将其煮沸
或者可以选择做bead-basedELISA
3.免疫珠分离法
3.1用主要的抗体孵化免疫磁珠2小时于室温,用ELISA缓冲液冲洗
3.2再加入二抗(辣根过氧化物酶)孵化1小时,然后大量的冲洗之
3.3为了可以被侦测到,需加入底物BMBluePODSubstrate(Roche),孵化10分钟为了终止反应,加入硫酸,并在450nm波长下读数
4.材料
a)商品化的磁珠
b)辣根过氧化物酶二抗
c)辣根过氧化物酶的底物
d)酶标仪
e)PBST