1、1.5 快速地使用或置于-80中待用为检测外泌体的蛋白浓度,取2L的样品置于卡上,用Direct Detect(Millipore)12 材料a) 细胞培养液b) 蛋白酶抑制(Sigma)c) 过滤筛(Millipore)d) 冷的 PBSe) 低粘附的管f) Direct Detect(Millipore)二、 以超高速离心的方法来分离外泌体(人血浆)1.1 在提取外泌体之前应该向血浆里添加1;500浓度比的蛋白酶抑制剂(Sigma)1.2 将上清液移至一个新的管中离心200*g 20分钟 41.3 小心地再将上清液移至新的管中 离心 10000*g 30分钟于4 来去除较大的囊泡、1.4
2、此阶段的样品可以1.5 将样品用0.22m的注射器滤筛(Millipore)过滤并且离心110000g (Sorvall WX ULTRA SERIES, rotor F65L) 2小时 41.6 用冷的PBS重悬后再次超速离心(110,000g, 1 h, 4 ).,1.7 将外泌体小心干燥并且用冷的PBS重悬1.8 外泌体应该立即使用或-80摄氏度冷藏2. 材料a) 蛋白酶抑制(Sigma)b) 过滤筛(Millipore)c) 冷的 PBSd) 低粘附的管e) Direct Detect(Millipore)三、 ExoQuickTM 化学沉淀法1.1 ExoQuickTM 的使用要按照
3、厂家提供的说明书来实行1.2 该试剂盒可以简单地提取CM,人血浆,和血清里的外泌体,只需用倒相管按照所指示的量来加入ExoQuickTM试剂盒里的溶液1.3 溶液孵化过夜,在4 温和的摇晃1.4 在流式细胞仪缓冲液中洗涤1.5 试剂盒里的带荧光的免疫磁珠已经被绑定,用流式细胞仪鉴定即可(BD Biosciences) 配合使用CellQuest 的软件。a) ExoQuickTM试剂盒b) 流式细胞仪四、 用METM分离外泌体1.1 样品(CM或人血清)要按照商品说明书(New England Peptide NEP)稀释1.2 样品要事先处理好,17,000g 7分钟 来去除微粒物质1.3
4、然后用METM试剂来孵化样品(NEP peptide)并且用旋转震荡在室温混合15分钟1.4 孵化完的样品要室温离心10000g 7分钟1.5 所有的样品要用PBS洗三次1.6 最后小囊泡要用合适的KIT缓冲液重悬五、 抗体以下的外泌体有关的一抗和二抗是用作:Westen Blot,ELISA和FACS(流式细胞术)1.1 mAb aCD9, mAb aCD63, mAb aCD81, mAb aCD63-FITC, aCD81-PE, 来自于 Beckton Dickinson, 1.2 mAb aCD63-biotin (BioLegend),1.3 mAb aAlix (Santa Cr
5、uz),1.4 mAb aTsg101 (Abcam),1.5 pAb aRab5 (Santa Cruz),1.6 mrAb aRab5 (Epitomics), 1.7 mAb aCalnexin (Abcam),1.8 二抗是 anti-Mouse和 anti-Rabbit HRP-conjugated (Dako). 专门的肿瘤外泌体 (HBM1 and HBM2) 结合抗体 由 HansaBioMed R&D team.提供六、 用Westen Blot 探测外泌体的蛋白1.1 将样品用合适容积的蛋白loading Buffer(Lonza)重悬在合适的浓度下1.2 用SDS-pag
6、e分离外泌体的蛋白质1.3 把蛋白转到硝酸纤维素膜上(GE Healthcare)1.4 一二抗体孵化1.5 信号要在暗室里用ECL附加七、 外泌体免疫捕捉和蛋白定量 ELISA1.1 从已经加了不同抗体的96孔板(Nunc)里的细胞上清或者人血浆 为免疫捕捉 而筛选外泌体结合抗体(96孔板的抗体用碳酸氢盐缓冲液PH=9.6稀释,用0.5%BSA固定和1%的蔗糖稳定)1.2 PBS加入0.05% Tween-20(PBST)作为洗涤缓冲液,但如果有提示说明,应该用PBS稀释样品1.3 将外泌体样本,CM,人血浆样本加入96板孔内(最终容积为100l),孵化4过夜或者 室温2小时(可以使用商业化
7、的exosomes捕捉平板(HansaBioMed)1.4 传统上的protocol包含使用主要的抗体(aCD9或aCD63)在样品缓冲液(0.5%BSA PBS)中稀释2小时于4。1.5 在大量的冲洗后,用辣根过氧化物酶二抗(BioRad),在需要的地方用样品缓冲液1小时于4。基于BM Blue POD Substrate辣根过氧化物酶的底物 (Roche)反应的光密度反应,在450nm的酶标仪下记录Infinite_M1000 (TECAN)a) QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate(Thermo Scientific)要用连续的激发 光束在
8、325/425nmb) SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific)要先孵 化1分钟然后在酶标仪化学发光模式读数a) 96孔板b) 碳酸氢盐缓冲液PH=9.6c) BSA PBS Tween-20 蔗糖d) 辣根过氧化物酶二抗e) 辣根过氧化物酶的底物f) 酶标仪八、 磁珠捕获外泌体1. 商业化的预包裹的乳胶微球1.1 根据商品说明书(HansaBioMed)来分离外泌体1.2 每个样品先用1ml的PBS来稀释1.3 选用合适的珠子去孵化4过夜,旋转震荡。1.4 之后可以用离心的方法来分离(5000个
9、,10分钟),再用PBST洗涤3次。2. 磁珠分离法2.1 比较了“1m大小的链霉亲和素磁珠” (Thermo Scientific, 88816)和“亚显微大小的超磁力珠”(内部订购)2.2 先用PBST洗涤磁珠然后加入1.2g的抗体(外泌体结合的同种抗体,CD9抗体(Beckton Dickinson)2.3 生物素化的抗体用于链霉亲和素磁珠,然后用PBST洗三次,再用合适的固定剂固定(干酪素,BSA或人血清)室温1小时2.4 重悬于PBS,然后加入样品(CM或人血浆)2.5 为了最终可以富集磁珠到近108/ml,将其孵化过夜4摄氏度旋转rotation2.6 用电磁分离磁珠,在量化外泌体蛋白或提取外泌体RNA之前用PBST洗三次2.7 磁珠也会溶解于Laemmli buffer,所以在做为westen bolt先将其煮沸或者可以选择做bead-based ELISA3. 免疫珠分离法3.1 用主要的抗体孵化免疫磁珠2小时于室温,用ELISA缓冲液冲洗3.2 再加入二抗(辣根过氧化物酶)孵化1小时,然后大量的冲洗之3.3 为了可以被侦测到,需加入底物BM Blue POD Substrate (Roche),孵化10分钟为了终止反应,加入硫酸,并在450nm波长下读数4. 材料a) 商品化的磁珠b) 辣根过氧化物酶二抗c) 辣根过氧化物酶的底物d) 酶标仪e) PBST
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