exosomes外泌体实验方案_精品文档文档格式.docx

1、1.5 快速地使用或置于-80中待用为检测外泌体的蛋白浓度，取2L的样品置于卡上，用Direct Detect（Millipore）12 材料a） 细胞培养液b） 蛋白酶抑制（Sigma）c） 过滤筛（Millipore）d） 冷的 PBSe） 低粘附的管f） Direct Detect（Millipore）二、 以超高速离心的方法来分离外泌体（人血浆）1.1 在提取外泌体之前应该向血浆里添加1;500浓度比的蛋白酶抑制剂（Sigma）1.2 将上清液移至一个新的管中离心200*g 20分钟 41.3 小心地再将上清液移至新的管中 离心 10000*g 30分钟于4 来去除较大的囊泡、1.4

2、此阶段的样品可以1.5 将样品用0.22m的注射器滤筛（Millipore）过滤并且离心110000g （Sorvall WX ULTRA SERIES, rotor F65L） 2小时 41.6 用冷的PBS重悬后再次超速离心（110,000g, 1 h, 4 ）.，1.7 将外泌体小心干燥并且用冷的PBS重悬1.8 外泌体应该立即使用或-80摄氏度冷藏2. 材料a） 蛋白酶抑制（Sigma）b） 过滤筛（Millipore）c） 冷的 PBSd） 低粘附的管e） Direct Detect（Millipore）三、 ExoQuickTM 化学沉淀法1.1 ExoQuickTM 的使用要按照

3、厂家提供的说明书来实行1.2 该试剂盒可以简单地提取CM,人血浆，和血清里的外泌体，只需用倒相管按照所指示的量来加入ExoQuickTM试剂盒里的溶液1.3 溶液孵化过夜，在4 温和的摇晃1.4 在流式细胞仪缓冲液中洗涤1.5 试剂盒里的带荧光的免疫磁珠已经被绑定，用流式细胞仪鉴定即可（BD Biosciences） 配合使用CellQuest 的软件。a） ExoQuickTM试剂盒b） 流式细胞仪四、 用METM分离外泌体1.1 样品（CM或人血清）要按照商品说明书（New England Peptide NEP）稀释1.2 样品要事先处理好，17,000g 7分钟 来去除微粒物质1.3

4、然后用METM试剂来孵化样品（NEP peptide）并且用旋转震荡在室温混合15分钟1.4 孵化完的样品要室温离心10000g 7分钟1.5 所有的样品要用PBS洗三次1.6 最后小囊泡要用合适的KIT缓冲液重悬五、 抗体以下的外泌体有关的一抗和二抗是用作：Westen Blot，ELISA和FACS（流式细胞术）1.1 mAb aCD9, mAb aCD63, mAb aCD81, mAb aCD63-FITC, aCD81-PE, 来自于 Beckton Dickinson, 1.2 mAb aCD63-biotin （BioLegend）,1.3 mAb aAlix （Santa Cr

5、uz）,1.4 mAb aTsg101 （Abcam）,1.5 pAb aRab5 （Santa Cruz）,1.6 mrAb aRab5 （Epitomics）, 1.7 mAb aCalnexin （Abcam）,1.8 二抗是 anti-Mouse和 anti-Rabbit HRP-conjugated （Dako）. 专门的肿瘤外泌体 （HBM1 and HBM2） 结合抗体 由 HansaBioMed R&D team.提供六、 用Westen Blot 探测外泌体的蛋白1.1 将样品用合适容积的蛋白loading Buffer（Lonza）重悬在合适的浓度下1.2 用SDS-pag

6、e分离外泌体的蛋白质1.3 把蛋白转到硝酸纤维素膜上（GE Healthcare）1.4 一二抗体孵化1.5 信号要在暗室里用ECL附加七、 外泌体免疫捕捉和蛋白定量 ELISA1.1 从已经加了不同抗体的96孔板（Nunc）里的细胞上清或者人血浆 为免疫捕捉 而筛选外泌体结合抗体（96孔板的抗体用碳酸氢盐缓冲液PH=9.6稀释，用0.5%BSA固定和1%的蔗糖稳定）1.2 PBS加入0.05% Tween-20（PBST）作为洗涤缓冲液，但如果有提示说明，应该用PBS稀释样品1.3 将外泌体样本，CM，人血浆样本加入96板孔内（最终容积为100l），孵化4过夜或者 室温2小时（可以使用商业化

7、的exosomes捕捉平板（HansaBioMed）1.4 传统上的protocol包含使用主要的抗体（aCD9或aCD63）在样品缓冲液（0.5%BSA PBS）中稀释2小时于4。1.5 在大量的冲洗后，用辣根过氧化物酶二抗（BioRad），在需要的地方用样品缓冲液1小时于4。基于BM Blue POD Substrate辣根过氧化物酶的底物 （Roche）反应的光密度反应，在450nm的酶标仪下记录Infinite_M1000 （TECAN）a） QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate（Thermo Scientific）要用连续的激发 光束在

8、325/425nmb） SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate （Thermo Scientific）要先孵 化1分钟然后在酶标仪化学发光模式读数a） 96孔板b） 碳酸氢盐缓冲液PH=9.6c） BSA PBS Tween-20 蔗糖d） 辣根过氧化物酶二抗e） 辣根过氧化物酶的底物f） 酶标仪八、 磁珠捕获外泌体1. 商业化的预包裹的乳胶微球1.1 根据商品说明书（HansaBioMed）来分离外泌体1.2 每个样品先用1ml的PBS来稀释1.3 选用合适的珠子去孵化4过夜，旋转震荡。1.4 之后可以用离心的方法来分离（5000个

9、，10分钟），再用PBST洗涤3次。2. 磁珠分离法2.1 比较了“1m大小的链霉亲和素磁珠” （Thermo Scientific, 88816）和“亚显微大小的超磁力珠”（内部订购）2.2 先用PBST洗涤磁珠然后加入1.2g的抗体（外泌体结合的同种抗体，CD9抗体（Beckton Dickinson）2.3 生物素化的抗体用于链霉亲和素磁珠，然后用PBST洗三次，再用合适的固定剂固定（干酪素，BSA或人血清）室温1小时2.4 重悬于PBS，然后加入样品（CM或人血浆）2.5 为了最终可以富集磁珠到近108/ml，将其孵化过夜4摄氏度旋转rotation2.6 用电磁分离磁珠，在量化外泌体蛋白或提取外泌体RNA之前用PBST洗三次2.7 磁珠也会溶解于Laemmli buffer，所以在做为westen bolt先将其煮沸或者可以选择做bead-based ELISA3. 免疫珠分离法3.1 用主要的抗体孵化免疫磁珠2小时于室温，用ELISA缓冲液冲洗3.2 再加入二抗（辣根过氧化物酶）孵化1小时，然后大量的冲洗之3.3 为了可以被侦测到，需加入底物BM Blue POD Substrate （Roche），孵化10分钟为了终止反应，加入硫酸，并在450nm波长下读数4. 材料a） 商品化的磁珠b） 辣根过氧化物酶二抗c） 辣根过氧化物酶的底物d） 酶标仪e） PBST