SNP开发验证的研究方法和技术路线Word格式.docx

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通过建立稳定、可靠得番茄DＮＡ提取流程与优化PCＲ反应体系，筛选具有一致性、稳定性与多态性SNP分子标记引物，从而构建番茄全基因组SNP分子标记。

全基因组得SNP分子标记，可以用于番茄QTＬ定位群体得检测，分子标记辅助育种得选择以及全基因组选择得群体基因型得检测。

同时，从中挑选高质量,高信息量得分子标记用于构建一套完成得番茄指纹图谱，检测品种一致性。

1、3、1供试材料:

22份材料得DNA用作特异性引物筛选，2份水作为NTＣ（NoneTeｍｐlａteCｏｎtrol）,共计２4份模板作为ＳNＰ引物得初期筛选。

以上实验在Q6仪器上进行。

对于筛选获得得一致性引物，在利用94株番茄自交系与2份水作为模板，进一步在Ｄouglas仪器上验证。

１、3、2DNＡ提取:

1、　取～10mg植物组织，加入研磨介质与4０0μｌ裂解液，研磨5mｉn,３000ｇ离心5mｉｎ。

２、加入裂解液1/3　体积得提取液，旋涡振荡混匀，冰浴（或置于－20℃冰箱中）5min,于４℃，32００×

g离心1０ｍin,吸取上清３00～400μl加入到样品板中。

3、按照下表在各９6孔板中加入试剂：

板号

板型

板名

成分

样品及试剂体积

1

Ｍiｃｒotｉtｅr　deepweｌl　96plａｔe

样品板（Lysiｓ）

样品反应液

无水乙醇

300~400μl

400μl

2

Micｒoｔiｔｅｒdeepｗell　96pｌａte

洗涤板I（W1）

PＷ

磁珠

800μl

3０μl

3

Ｍicrotｉteｒ　dｅepweｌl　９6ｐｌate

洗涤板ＩI（Ｗ２）

8０％乙醇

磁套

8０0μl

4

ＫingＦisher96ＫFpｌaｔe

洗脱板（Eｌutioｎ）

TＥ1、0

5０～1０0μｌ

4、将各96孔板按仪器提示顺序放入仪器中，运行程序。

５、　程序运行结束后，将DNA溶液转移PCR板中并测量浓度（>

100ng/μl），进行后续实验或于-20℃保存待用。

1、3、３分子标记命名：

分子标记全部采用统一得命名规则，这样有利于结果得修改与维护。

例如:

名称

ID

SＮP位点

正向引物

反向引物

模板序列

SolBeckman—00001-Ｖ1

Ｓol000０1

A/G

引物合成：

由上海生工公司负责引物合成。

１、3、4SNP分子标记得开发：

最近,Sim等人利用番茄得Iｌlｕｍina芯片检测４１0份自交系与16份番茄品种得基因型。

本研究在此基础上,利用Illｕmina开发得7，72０条探针序列，选择其中丢失频率小于１0％,等位基因频率大于10％得探针序列，获得～3，500条探针序列,作为SNP引物开发得模板序列（），每条序列得长度为~1０0bp，SNP上下游各５0bp。

初期，我们可以从~3５0０条探针中，选取~12０探针序列作为模板发展引物,这１20条序列要求分布在1２条染色体上而且在每条染色体上尽量保证均匀分布。

如果实验成功,我们可以逐步地将剩余得探针序列发展成为SNP引物。

１、３、5正向引物设计:

由于我们需要使用KAＳP基因分型检测试剂盒,本试剂盒对正向引物已经确定为SNP位点上游~20ｂp（包括SＮP位点），同时需要人工加上FAM或就是HEＸ序列（图１、２）。

因此，我们需要单独设计反向引物。

图1、２　正向引物设计

1、3、6反向引物设计：

利用Primｅr3、0软件对模板序列进行引物选择，引物参数设定如下：

１引物长度为18～25bp；

2GC含量为40～60％；

3TM值５8～6２°

C.

如果其上述模板序列不足以满足引物开发得需要：

我们可以利用剩余～4,200条探针,继续开发新得引物。

另外,我们还可以利用PＣR产物测序得方式获得gaｐ中序列，寻找新得ＳＮP位点。

1、3、6　PCR反应：

PＣR反应体系：

PCＲ反应体系需要保证均一化,这样可以满足将来在Douｇlas系统下进行SＮP检测.初期我们会在Q6仪器上进行预实验，摸索一致后，再在Douglas系统中进行。

PrimerMix反应体系:

体积（μl）

ＦAM－Ｐrimｅr

1２

HEX－Ｐriｍer

１2

Ｒevｅrse-Priｍer

３0

ddH2O

4６

Toｔal

100

PCR反应体系：

Ｒeacｔion　Mｉx

2、５

ＰrimeｒMix

０、7

ｄｄH２Ｏ

0、8

DNA

１

Ｔｏtal

5

1、3、７　PCR反应程序:

我们得PCR产物应该都为＜100bp，因此我们可以采用统一设定,保证均一化。

采用两步法进行PＣR反应，前期筛选引物我们设计3个复性梯度：

6０°

Ｃ、5７°

Ｃ以及55°

Ｃ，以便找到最合适得复性温度。

首先，利用6０°

C得复性温度进行筛选:

步骤

参数

意义

2５°

C　1：

３0min

反应前收集荧光

２

94°

Ｃ１0ｍin

预变性

C15s

变性

４

６０°

C　1min

复性,延伸

3—4重复４0个循环

６

２5°

Ｃ1：

３０miｎ

反应完收集荧光

如果SNP引物在６０°

Ｃ复性温度时扩增结果正常，则保留该引物在６0°

C复性进行PCR反应。

如果得到引物扩增效果不好,则降低复性温度，利用５7°

C进行复性.

57°

C复性温度ＰCR反应程序筛选：

25°

C　1:

３0miｎ

C　10ｍin

C1５s

５７°

C1mｉn

复性，延伸

３－４重复４0个循环

6

C　１：

30min

如果ＳNP引物在5７°

C复性温度时扩增结果正常,则保留该引物在57°

Ｃ复性进行PCR反应。

如果得到引物扩增效果不好,则降低复性温度,利用55°

C进行复性.最终，如果5５°

C复性温度时，反应结果不好，则该ＳNP引物剔除去掉。

5５°

C复性温度PCR反应程序筛选：

30ｍin

Ｃ10miｎ

３

９4°

Ｃ15s

55°

Ｃ　1mｉｎ

５

3—４重复40个循环

２５°

C１：

1、３、８SNＰ分子标记准确性验证:

对于已在21份模板DNＡ扩增稳定得SNP引物,需要进一步在大群体中验证其稳定性、一致性、多态性。

选择84份番茄自交系或品种得DＮA，通过相同得PCR方法，验证新开发得ＳNP分子标记。

1、3、9目标要求：

番茄全基因组SNP标记：

在番茄得全基因上,我们获得12００对特异得ＳＮP引物（平均100对/染色体）覆盖番茄得全基因组。

已获得在1２份模板ＤＮＡ能够稳定扩增得ＳNP分子标记,全部保留.

2分子标记辅助育种：

2、1ＩLs群体：

如果利用现在群体不再进一步构建亚群体，IＬs群体（Ｌ　pennellii渐渗系群体）～76个自交系，整个群体数目较小,不利于定位及QTLｓ验证（图2、1）。

但就是对于这些材料得渗入片段都已经注视清楚，因此我们可以直接比较深入系与M８2自交系得表型差异,如果存在显著性差异,则可以定义为有深入片段引起得表型差异。

当鉴定结果与已定位得QTＬｓ信息一致时,我们就认为此QTL在区间内。

同时我们要检索此QTL定位时得位置,以此为基础发展SNP标记，用于以后分子标记辅助育种。

对于每个QＴＬ得区间，需要发展4~8个SＮP标记覆盖其定位区间（图1、１）,其中,区间外两段各一个标记，内部2～６个SNＰ标记.这样可以保证目标QTL被完整得应用。

SNP标记得开发，此时得SＮＰ标记只需要在IＬｓ群体得两个亲本中有多态性就可以应用。

引物设计同全基因组ＳNP引物设计相同。

性状验证:

对于确定得ＱＴLs,我们需要开发对应得SNＰ标记,利用这些标记重新验证定位结果：

图2、1　深入系材料得基因型

2.2IBLｓ群体:

IＢLｓ群体本身就就是分离群体,因此可以直接用作定位（图2、2）。

如果该群体基因型已经被鉴定，我们可以直接利用鉴定得基因型结合我们自己调查得表型，获得ＱTL初定位得结果。

同时，利用Ａffymetrｉx芯片进行全基因组得SNP检测，然后与表型数据相结合进行分析.然后，需要查瞧定位得QＴL区间内就是否存在3Dｏuglaｓ系统下SNP标记,如果满足分子标记辅助育种得应用，可以直接应用.如果ＱTＬ区间内得没有或就是过少得SNP标记,则需要重新开发ＳNP标记（标记开发同上）。

图2、２IBLs群体构建

2、3性状调查：

从我得观点出发,对于分子育种比较有价值研究得QTＬ,应为育种家需求得性状所对应得QTL。

我认为我们需要跟番茄育种家合作并讨论育种需求与育种目标。

鉴于目前ＩLs群体定位情况（表１，表2），我认为我们可以从中选择一些我们能够鉴定测量得性状进行研究，例如:

糖分,可溶性固形物得含量，果实形状与大