SNP开发验证的研究方法和技术路线Word格式.docx

1、通过建立稳定、可靠得番茄D提取流程与优化PC反应体系，筛选具有一致性、稳定性与多态性SNP分子标记引物，从而构建番茄全基因组SNP分子标记。全基因组得SNP分子标记，可以用于番茄QT定位群体得检测，分子标记辅助育种得选择以及全基因组选择得群体基因型得检测。同时，从中挑选高质量,高信息量得分子标记用于构建一套完成得番茄指纹图谱，检测品种一致性。1、3、1 供试材料:22份材料得DNA用作特异性引物筛选，2份水作为NT（None Telte Ctrol）,共计4份模板作为N引物得初期筛选。以上实验在Q6仪器上进行。对于筛选获得得一致性引物，在利用94株番茄自交系与2份水作为模板，进一步在ougla

2、s仪器上验证。、3、2 DN提取:1、取10mg 植物组织，加入研磨介质与40 裂解液，研磨5mn,000离心5m。、 加入裂解液1/3体积得提取液，旋涡振荡混匀，冰浴（或置于20冰箱中）5min,于，32g 离心1in,吸取上清00400l 加入到样品板中。3、 按照下表在各6 孔板中加入试剂：板号板型板名成分样品及试剂体积1iottrdeep wel96ple样品板（Lysi）样品反应液无水乙醇300400l400l2Micoi deep ell96pte洗涤板I（W1）P磁珠800l3l3icrottedep wel6ate洗涤板I（）8乙醇磁套80l4ingisher 96 F pae

3、洗脱板（Eutio）T1、05104、 将各96 孔板按仪器提示顺序放入仪器中，运行程序。、程序运行结束后，将DNA 溶液转移PCR 板中并测量浓度（100ng/l），进行后续实验或于-20保存待用。1、3、 分子标记命名：分子标记全部采用统一得命名规则，这样有利于结果得修改与维护。例如:名称IDSP位点正向引物反向引物模板序列SolBeckman00001-1ol0001A/G引物合成：由上海生工公司负责引物合成。、3、4 SNP分子标记得开发：最近,Sim等人利用番茄得Ilina芯片检测0份自交系与16份番茄品种得基因型。本研究在此基础上,利用Illmina开发得7，72条探针序列，选择其

4、中丢失频率小于0,等位基因频率大于10得探针序列，获得3，500条探针序列,作为SNP引物开发得模板序列（），每条序列得长度为10bp，SNP 上下游各0bp。初期，我们可以从30条探针中，选取12探针序列作为模板发展引物,这20条序列要求分布在1条染色体上而且在每条染色体上尽量保证均匀分布。如果实验成功,我们可以逐步地将剩余得探针序列发展成为SNP引物。、5正向引物设计:由于我们需要使用KAP基因分型检测试剂盒,本试剂盒对正向引物已经确定为SNP位点上游20p（包括SP位点），同时需要人工加上FAM或就是HE序列（图、）。因此，我们需要单独设计反向引物。图1、正向引物设计1、3、6反向引物设

5、计：利用Primr3、0软件对模板序列进行引物选择，引物参数设定如下： 引物长度为1825bp；2 GC含量为4060；3 TM值86C.如果其上述模板序列不足以满足引物开发得需要：我们可以利用剩余4,200条探针,继续开发新得引物。另外,我们还可以利用PR产物测序得方式获得ga中序列，寻找新得P位点。1、3、6PCR反应：PR反应体系：PC反应体系需要保证均一化,这样可以满足将来在Doulas系统下进行SP检测.初期我们会在Q6仪器上进行预实验，摸索一致后，再在Douglas系统中进行。Primer Mix反应体系:体积（l）AMrimr1HEXrier2evrse-Prier0ddH2O4

6、Toal100PCR反应体系：eacionMx2、rime Mix、7H0、8DNAtal51、3、PCR反应程序:我们得PCR产物应该都为100bp，因此我们可以采用统一设定,保证均一化。采用两步法进行PR反应，前期筛选引物我们设计3个复性梯度：6、5以及55，以便找到最合适得复性温度。首先，利用6C得复性温度进行筛选:步骤参数意义2C1：0min反应前收集荧光94 0in预变性C 15s变性C1min复性,延伸34重复0个循环5 1：mi反应完收集荧光如果SNP引物在复性温度时扩增结果正常，则保留该引物在0C复性进行PCR反应。如果得到引物扩增效果不好,则降低复性温度，利用7C进行复性.5

7、7 C复性温度CR反应程序筛选：25C1:0miC10inC 1sC 1mn复性，延伸重复0个循环6C：30min如果NP引物在5C复性温度时扩增结果正常,则保留该引物在57复性进行PCR反应。如果得到引物扩增效果不好,则降低复性温度,利用55C进行复性.最终，如果5C复性温度时，反应结果不好，则该NP引物剔除去掉。5C复性温度PCR反应程序筛选：30in 10mi4 15s551m3重复40个循环C ：1、 SN分子标记准确性验证:对于已在21份模板DN扩增稳定得SNP引物,需要进一步在大群体中验证其稳定性、一致性、多态性。选择84份番茄自交系或品种得DA，通过相同得PCR方法，验证新开发得

8、NP分子标记。1、3、9目标要求：番茄全基因组SNP标记：在番茄得全基因上,我们获得12对特异得P引物（平均100对/染色体）覆盖番茄得全基因组。已获得在1份模板能够稳定扩增得NP分子标记,全部保留.2分子标记辅助育种：2、1 Ls群体：如果利用现在群体不再进一步构建亚群体，Is群体（pennellii渐渗系群体）76个自交系，整个群体数目较小,不利于定位及QTL验证（图2、1）。但就是对于这些材料得渗入片段都已经注视清楚，因此我们可以直接比较深入系与M2自交系得表型差异,如果存在显著性差异,则可以定义为有深入片段引起得表型差异。当鉴定结果与已定位得QT信息一致时,我们就认为此QTL在区间内。

9、同时我们要检索此QTL定位时得位置,以此为基础发展SNP标记，用于以后分子标记辅助育种。对于每个Q得区间，需要发展48个SP标记覆盖其定位区间（图1、）,其中,区间外两段各一个标记，内部2个SN标记.这样可以保证目标QTL被完整得应用。SNP标记得开发，此时得S标记只需要在I群体得两个亲本中有多态性就可以应用。引物设计同全基因组NP引物设计相同。性状验证:对于确定得Ls,我们需要开发对应得SN标记,利用这些标记重新验证定位结果：图2、1深入系材料得基因型2.2 IBL群体:IL群体本身就就是分离群体,因此可以直接用作定位（图2、2）。如果该群体基因型已经被鉴定，我们可以直接利用鉴定得基因型结合

10、我们自己调查得表型，获得TL初定位得结果。同时，利用ffymetrx芯片进行全基因组得SNP检测，然后与表型数据相结合进行分析.然后，需要查瞧定位得QL区间内就是否存在3 Dugla系统下SNP标记,如果满足分子标记辅助育种得应用，可以直接应用.如果T区间内得没有或就是过少得SNP标记,则需要重新开发NP标记（标记开发同上）。图2、 IBLs群体构建2、3性状调查：从我得观点出发,对于分子育种比较有价值研究得QT,应为育种家需求得性状所对应得QTL。我认为我们需要跟番茄育种家合作并讨论育种需求与育种目标。鉴于目前Ls群体定位情况（表，表2），我认为我们可以从中选择一些我们能够鉴定测量得性状进行研究，例如:糖分,可溶性固形物得含量，果实形状与大