1、通过建立稳定、可靠得番茄D提取流程与优化PC反应体系,筛选具有一致性、稳定性与多态性SNP分子标记引物,从而构建番茄全基因组SNP分子标记。全基因组得SNP分子标记,可以用于番茄QT定位群体得检测,分子标记辅助育种得选择以及全基因组选择得群体基因型得检测。同时,从中挑选高质量,高信息量得分子标记用于构建一套完成得番茄指纹图谱,检测品种一致性。1、3、1 供试材料:22份材料得DNA用作特异性引物筛选,2份水作为NT(None Telte Ctrol),共计4份模板作为N引物得初期筛选。以上实验在Q6仪器上进行。对于筛选获得得一致性引物,在利用94株番茄自交系与2份水作为模板,进一步在ougla
2、s仪器上验证。、3、2 DN提取:1、取10mg 植物组织,加入研磨介质与40 裂解液,研磨5mn,000离心5m。、 加入裂解液1/3体积得提取液,旋涡振荡混匀,冰浴(或置于20冰箱中)5min,于,32g 离心1in,吸取上清00400l 加入到样品板中。3、 按照下表在各6 孔板中加入试剂:板号板型板名成分样品及试剂体积1iottrdeep wel96ple样品板(Lysi)样品反应液无水乙醇300400l400l2Micoi deep ell96pte洗涤板I(W1)P磁珠800l3l3icrottedep wel6ate洗涤板I()8乙醇磁套80l4ingisher 96 F pae
3、洗脱板(Eutio)T1、05104、 将各96 孔板按仪器提示顺序放入仪器中,运行程序。、程序运行结束后,将DNA 溶液转移PCR 板中并测量浓度(100ng/l),进行后续实验或于-20保存待用。1、3、 分子标记命名:分子标记全部采用统一得命名规则,这样有利于结果得修改与维护。例如:名称IDSP位点正向引物反向引物模板序列SolBeckman00001-1ol0001A/G引物合成:由上海生工公司负责引物合成。、3、4 SNP分子标记得开发:最近,Sim等人利用番茄得Ilina芯片检测0份自交系与16份番茄品种得基因型。本研究在此基础上,利用Illmina开发得7,72条探针序列,选择其
4、中丢失频率小于0,等位基因频率大于10得探针序列,获得3,500条探针序列,作为SNP引物开发得模板序列(),每条序列得长度为10bp,SNP 上下游各0bp。初期,我们可以从30条探针中,选取12探针序列作为模板发展引物,这20条序列要求分布在1条染色体上而且在每条染色体上尽量保证均匀分布。如果实验成功,我们可以逐步地将剩余得探针序列发展成为SNP引物。、5正向引物设计:由于我们需要使用KAP基因分型检测试剂盒,本试剂盒对正向引物已经确定为SNP位点上游20p(包括SP位点),同时需要人工加上FAM或就是HE序列(图、)。因此,我们需要单独设计反向引物。图1、正向引物设计1、3、6反向引物设
5、计:利用Primr3、0软件对模板序列进行引物选择,引物参数设定如下: 引物长度为1825bp;2 GC含量为4060;3 TM值86C.如果其上述模板序列不足以满足引物开发得需要:我们可以利用剩余4,200条探针,继续开发新得引物。另外,我们还可以利用PR产物测序得方式获得ga中序列,寻找新得P位点。1、3、6PCR反应:PR反应体系:PC反应体系需要保证均一化,这样可以满足将来在Doulas系统下进行SP检测.初期我们会在Q6仪器上进行预实验,摸索一致后,再在Douglas系统中进行。Primer Mix反应体系:体积(l)AMrimr1HEXrier2evrse-Prier0ddH2O4
6、Toal100PCR反应体系:eacionMx2、rime Mix、7H0、8DNAtal51、3、PCR反应程序:我们得PCR产物应该都为100bp,因此我们可以采用统一设定,保证均一化。采用两步法进行PR反应,前期筛选引物我们设计3个复性梯度:6、5以及55,以便找到最合适得复性温度。首先,利用6C得复性温度进行筛选:步骤参数意义2C1:0min反应前收集荧光94 0in预变性C 15s变性C1min复性,延伸34重复0个循环5 1:mi反应完收集荧光如果SNP引物在复性温度时扩增结果正常,则保留该引物在0C复性进行PCR反应。如果得到引物扩增效果不好,则降低复性温度,利用7C进行复性.5
7、7 C复性温度CR反应程序筛选:25C1:0miC10inC 1sC 1mn复性,延伸重复0个循环6C:30min如果NP引物在5C复性温度时扩增结果正常,则保留该引物在57复性进行PCR反应。如果得到引物扩增效果不好,则降低复性温度,利用55C进行复性.最终,如果5C复性温度时,反应结果不好,则该NP引物剔除去掉。5C复性温度PCR反应程序筛选:30in 10mi4 15s551m3重复40个循环C :1、 SN分子标记准确性验证:对于已在21份模板DN扩增稳定得SNP引物,需要进一步在大群体中验证其稳定性、一致性、多态性。选择84份番茄自交系或品种得DA,通过相同得PCR方法,验证新开发得
8、NP分子标记。1、3、9目标要求:番茄全基因组SNP标记:在番茄得全基因上,我们获得12对特异得P引物(平均100对/染色体)覆盖番茄得全基因组。已获得在1份模板能够稳定扩增得NP分子标记,全部保留.2分子标记辅助育种:2、1 Ls群体:如果利用现在群体不再进一步构建亚群体,Is群体(pennellii渐渗系群体)76个自交系,整个群体数目较小,不利于定位及QTL验证(图2、1)。但就是对于这些材料得渗入片段都已经注视清楚,因此我们可以直接比较深入系与M2自交系得表型差异,如果存在显著性差异,则可以定义为有深入片段引起得表型差异。当鉴定结果与已定位得QT信息一致时,我们就认为此QTL在区间内。
9、同时我们要检索此QTL定位时得位置,以此为基础发展SNP标记,用于以后分子标记辅助育种。对于每个Q得区间,需要发展48个SP标记覆盖其定位区间(图1、),其中,区间外两段各一个标记,内部2个SN标记.这样可以保证目标QTL被完整得应用。SNP标记得开发,此时得S标记只需要在I群体得两个亲本中有多态性就可以应用。引物设计同全基因组NP引物设计相同。性状验证:对于确定得Ls,我们需要开发对应得SN标记,利用这些标记重新验证定位结果:图2、1深入系材料得基因型2.2 IBL群体:IL群体本身就就是分离群体,因此可以直接用作定位(图2、2)。如果该群体基因型已经被鉴定,我们可以直接利用鉴定得基因型结合
10、我们自己调查得表型,获得TL初定位得结果。同时,利用ffymetrx芯片进行全基因组得SNP检测,然后与表型数据相结合进行分析.然后,需要查瞧定位得QL区间内就是否存在3 Dugla系统下SNP标记,如果满足分子标记辅助育种得应用,可以直接应用.如果T区间内得没有或就是过少得SNP标记,则需要重新开发NP标记(标记开发同上)。图2、 IBLs群体构建2、3性状调查:从我得观点出发,对于分子育种比较有价值研究得QT,应为育种家需求得性状所对应得QTL。我认为我们需要跟番茄育种家合作并讨论育种需求与育种目标。鉴于目前Ls群体定位情况(表,表2),我认为我们可以从中选择一些我们能够鉴定测量得性状进行研究,例如:糖分,可溶性固形物得含量,果实形状与大
copyright@ 2008-2022 冰豆网网站版权所有
经营许可证编号:鄂ICP备2022015515号-1