昆明医学院教案Word格式.docx

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1.掌握DNA序列多态性概念；

2.熟悉DNA测序原理和基本技术；

3.熟悉mtDNA检测方法及法医学应用价值评价。

4.了解序列多态性的其他分析技术。

五、本章节重点、难点

重点：

1.DNA序列多态性概念；

2.mtDNA检测方法及法医学应用。

难点：

DNA测序原理和基本技术

六、教学方法（请打勾）

传统式、提问式、学导式、病案分析式、直观教学式（幻灯、手术、录像）、自学式、其它：

七、使用教具:

多媒体

八、思考题：

1.何谓PCR循环测序？

2.试评估mtDNA在个体识别中的鉴定意义

九、要求参考书目及章节：

1、《实用法医学》，郭景元主编

2、《法医物证学》，吴梅筠主编（第一版）

3、《人类DNA遗传标记》，李生斌著

4、《法医DNA分析》，郑秀芬著

十、讲课内容及时数安排

时间：

5min

幻灯片

30min

10min

基因组DNA碱基序列差异是不同个体间最本质的遗传差异，在特定的基因座上等位基因之间碱基序列差异构成的DNA多态性叫作序列多态性（sequencepolymorphism）。

（Sequencepolymorphismisthebasesequencedifferencebetweentwofragmentsinoneloci.）

同一个体不同组织细胞中的基因组DNA序列是一致的，这是分析DNA序列认定同一性的前提条件。

序列多态性分析在法医生物学检材的个体识别鉴定具有重要的实用价值，通过比较不同法医物证检材的DNA序列，可以获得是否来自同一个体的信息。

DNA序列多态性分析技术很多，各具特色。

常用有DNA序列测定技术、反向斑点杂交技术、PCR-RFLP技术、序列特异性PCR技术等。

其他还有SSCP分析，MVR-PCR技术等。

近10年来，高新技术如DNA芯片，DHPLC和MALDI-TOF-MS分析技术等应用研究发展很快，在DNA序列多态性检测上正在发挥越来越重要的作用。

第一节DNA序列测定及多态性分析

一、DNA测序原理和基本技术

（一）双脱氧核苷酸链终止法（Chainterminationmethodwithdideoxynucleotide）

1．基本原理

DNA的复制有4个基本条件：

DNA聚合酶、单链DNA模板、寡核苷酸引物、dNTP（dATP，dCTP，dGTP，dTTP）。

在复制反应体系中，引物与模板退火形成双链区后，DNA聚合酶立刻结合到DNA双链区并启动DNA的合成。

在引物的引导下，聚合酶在模板链上沿3’→5’的方向移动，dNTP按照碱基配对原则，逐个连接在引物的3’-OH末端，引物以5’→3’方向延伸并聚合成一条与2模板链互补的DNA新生链。

如果在DNA合成反应体系中加入双脱氧核苷三磷酸（2’,3’-ddNTP），DNA的合成过程则有变化。

2’,3’-ddNTP与dNTP的区别在于脱氧核糖的C3位置缺少-OH，ddNTP可以在聚合酶作用下，与正在延伸的引物链3’-OH末端反应，形成3’,5’-磷酸二酯键而掺入到DNA链中，但由于没有3’-OH，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，使正在延伸的引物链在此终止。

在DNA测序系统中，除了加入正常反应所必需的4种dNTP外，还加入一定比例的ddNTP，链合成反应过程中ddNTP与dNTP处于一种竞争状态，即新合成DNA链既可能掺入正常dNTP，也可能掺入ddNTP并使新合成链终止延伸。

结果DNA合成反应的产物是一系列长度不等的多核苷酸片段，这些片段具有相同的起点，即引物的5’端，但有不同ddNTP终端。

一般在一个模板DNA的测序反应中，设置一套四组反应体系：

A、T、G和C。

每组反应对应一种碱基，体系中除加入的dNTP外，分别加有相应的ddATP、ddTTP、ddGTP或ddCTP，4个体系的新生链都可随机地被相应ddNTP终止，则可形成各种长度的DNA新生链。

然后通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分4泳道分别分离不同长度的DNA片段，检测被终止的DNA片段长度并同时确定该位置的碱基种类，可以直接读出靶DNA片段的序列（图5-1-1双脱氧核苷酸链终止测序基本原理）。

显示电泳分离片段最简单的方法是银染，但传统的方法是高灵敏度的32P同位素标记技术。

（Duringtheextendingstep,thedideoxynucleotidecompetewithdeoxyribonucleotidetoConnectatthe3'

-OHendoftheprimer,asthedideoxynucleotides’connectionstopthefurtherlinkage,thereproducealllengthoffragmentwhosetailcanbetestedout.）

双脱氧链终止测序方法有三个步骤：

准备DNA测序模板；

进行链合成反应即测序反应和通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离片段,显带并读出序列。

（ThreestepsinChainterminationmethodwithdideoxynucleotide:

DNAtemplate,Ionophorticseparation，Banding.）

（二）PCR循环测序★PCRcyclesequencing

PCR技术能够快速、特异性地扩增靶DNA，应用PCR技术测定DNA序列分两个步骤：

先利用PCR扩增靶序列片段，制备测序模板，然后再利用PCR直接测定序列。

PCR测序采用了热循环高效合成DNA的特性并结合双脱氧核苷酸终止法，使引物链终止的延伸产物数量在热循环过程中得到增加，因此称为4循环测序。

一个测序反应循环结束后，与延伸产物互补结合的靶DNA模板经过高温变性，可再成为单链模板引发引物链的退火、延伸与终止，产生高显影度的序列梯带。

每个测序循环包括：

①PCR扩增制备的模板DNA变性成单链形式；

②标记引物与其中的一条链上的互补序列退火；

③退火后的引物在耐热DNA聚合酶催化下发生链延伸终止反应。

本次循环产生的模板链与延伸终止链形成的双链的产物，在下一轮测序循环中，再次被变性，释放出模板链，作为又一轮引发反应的模板，同时积累下每轮循环产生的链终止产物。

上述循环步骤重复20~40次，使链终止产物以线性方式获得扩增。

循环测序采用耐热DNA聚合酶，测序反应可以进行多次循环，因此循环测序是以双脱氧链终止法为基础的标准DNA测序方案，在方法学上是一个巨大的进步（图5-1-2循环测序原理）。

（UsethemethodofPCR）

2．基本技术

循环测序反应利用了PCR，但是与普通PCR有两点不同。

循环测序中，只需要一条引物，反应底物同时包括脱氧核苷三磷酸（dNTP）和双脱氧5核苷三磷酸（ddNTP）。

其次，通过单引物进行循环扩增，模板DNA是以线性方式获得扩增（图5-1-2）。

（DifferentfromnormalPCR,thereonlyneedoneprimer,theactingsubstratesincludenotonlythedNTPsbuttheddNTPs.ThisactionmadeDNAchainextendlinearity.）而不似标准PCR反应中以指数形式获得扩增。

这种线性方式的扩增中，每一个引物延伸的分子在模板链对应碱基位置处终止，通过一定的检测技术得到终止碱基的信号。

（三）DNA自动测序技术★（DNAautomaticalsequencingtechnology）

DNA自动测序技术是以4种荧光染料基团分别作为4种ddNTP终止链的标记物，于80年代末期建立的一种高效、快速、自动化的序列测定技术。

4种荧光染料分别作为测序反应中4种ddNTP终止链的标记物，即4种被双脱氧核苷酸终止的DNA片段分别带上4种不同的颜色。

这些DNA片段的混合物同时加在一个样品槽中电泳展开，相互间仅差1个碱基的DNA片段形成一条具有4种颜色的阶梯分布图像。

阶梯中的每一DNA片段由标记在该片段上的特征性荧光基团发出的荧光所指示。

（MadeallddNTPsFluorspardyed,thenthefragments’tailcanbetestedout.）

荧光染料基团作为标记物的基本要求是经过激光诱发的吸收光谱波长在可见光波长范围内，不影响延伸反应，不影响标记后DNA片段的电泳性质。

其次要求4种荧光的吸收和激发光波长要有足够的差异，便于检测。

（Thebasicofthisactionisthefluorochromemustnotdisturbtheprocess,thedifferenceofthesefourfluorochromecanbetested.）

荧光染料的掺入的方式有两种：

一种是将荧光染料预先标记在测序反应通用引物的5’端。

（Thefluorochromedyetheprimeronthe5’end,eachddNTPswillmaponekindoffluorochromelikeinoneprimer,theactionproceedin4testtubewithdifferentfluorochrome.）4种荧光标记形成4种标记引物，测序反应分4个反应管进行，特定的荧光染料与相应的ddNTP是对应关系，例如荧光示踪染料JOE标记的通用引物总是与ddATP加在同一个反应管内，因此由ddATP终止的所有延伸链都带有JOE。

这种方式被称为Dye-Primers。

另一种是将荧光染料基团连在ddNTP上，4种荧光染料分别与4种ddNTP底物连接，反应产生的4组DNA片段分别由特定ddNTP所终止，并且标记有4种不同的荧光发色基团，A、C、G和T分别携带有绿、红、蓝、黄4种荧光。

这种方式被称为Dye-Terminators。

（FourddNTPsismarkedfourdifferentfluorochrome,asthechainstopedbyddATP,itwillsendoutthefluorescenceastheddATPmarked.）

两种方式各有特点，不过前者要求A，G，C，T分4个反应进行，而后者的4组反应可以在同一管中完成。

上述两种方法都能确定4种荧光与4种ddNTP所终止的DNA片段之间的对应关系，这是后来从电泳中检测标记物信号以及最终读序的基础。

自动测序仪器无论是变性PAG平板凝胶电泳还是毛细管电泳，都配置有激光束激发系统和荧光信号收集检测系统。

当DNA片段电泳通过检测窗口时，在激光束的激发下，片段的电泳时间和被激发荧光的波长、强度等信号都被记录，由计算机自动作数据处理，最后在屏幕上显示每一样品的各终止片段电泳分离的模拟图像。

不同颜色的峰标示各自标记的碱基及其排列顺序（图5-1-3荧光标记末端终止法DNA序列测定结果）。