生物制品 质量标准内容及结构确证内容Word格式文档下载.docx

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（一）检测意义

获取准确的效价信息，保证产品有效

效价：

有效性指标，反映药品效力

生物学活性才能真实反映生物技术药效价

原因：

生物制品分子大、结构复杂、不稳定，使得重量与效价不一致

生物制品技术药：

~单位（U、AU、IU）

（二）生物学活性测定方法分类

1、动物基础的活性测定

离体动物器官法：

脑利钠肽的兔主动脉

体内测定法：

EPO的小鼠网织红细胞

2、细胞基础的活性测定

⏹促细胞生长法：

大多数细胞因子类

⏹抑制细胞生长法：

细胞毒素、血管抑制剂

⏹间接保护细胞法：

IFN保护WISH

3、酶学基础的活性测定：

重组酶类

4、受体-配体、抗原-抗体结合基础的活性测定：

抗原决定簇与活性中心常不一致

（三）生物学活性测定方法选择

1、细胞培养法＞离体器官法＞体内法

2、细胞染色标记方法：

MTT＞3H-Thymidine＞流式细胞仪（测细胞周期、凋亡）

3、定量法＞半定量法＞定性法

4、生物学活性不一定与临床药效类型一致

工艺稳定、测生物活性特别复杂时，可替代。

如rh-GH用HPLC

（四）生物学活性测定（见药典附录ⅩC）

1、样品：

原液、成品

2、方法：

如上述（好好研究？

？

）

3、标准：

不同生物活性测定方法的规定标准

测定方法规定标准

动物基础的活性测定70%-130%标示量

细胞基础的活性测定80%-120%标示量

酶学基础的活性测定85%-115%标示量

结合反应的活性测定85%-115%标示量

（五）蛋白质药物的比活性（见分生实验册77页）？

原液

2、定义与计算：

比活性：

单位重量蛋白的活性单位数（IU/mg）

不小于。

。

IU/mg

4、意义：

1）真实反映有活性的蛋白质所占的比例

厂家间、表达系统间、批间比较

2）便于配制成品

二蛋白质纯度检查

⏹样品：

⏹方法：

必须采用二种方法测定

非还原SDS-PAGE法

HPLC法

⏹标准：

纯度均须达到95%或98%以上

非还原SDS-PAGE法测定纯度（见药典附录ⅣC）

⏹SDS-PAGE：

据分子大小分离

⏹样品处理：

样品不加β-ME或DTT

二硫键未打开，反映单体、二聚体或多聚体情况

⏹染色方法与上样量

银染:

5ug（检测限为1-10ng）

考马斯亮蓝R-250：

10ug（检测限为0.1ug）

⏹定量方法：

凝胶扫描

无明显杂带，纯度≧95%或98%

HPLC法测纯度？

（见药典附录ⅢB）

⏹分析柱：

反相柱、离子柱、分子筛

应尽量采用反相柱或离子柱

应注明采用的分析柱性质

⏹上样量：

5ug

出峰时间正确纯度：

≧95%或98%

三、蛋白质含量测定（见药典附录ⅥD）

*Folin-酚试剂法（Lowry法）：

（见分生实验册67-73页）

简便、灵敏、优先采用，灵敏度：

5-100ug/ml

*染色法（Bradford法）：

考马斯亮蓝G-250，简便灵敏，25-200ug/ml

BCA（二喹啉甲酸）法：

操作简单，比Lowry法快4倍且更加方便，准确灵敏：

20~200ug/ml，微量BCA的测定范围在0.5~10ug/ml。

经济适用，抗试剂干扰能力比较强。

紫外分光广度法：

用于原液比活性计算和成品规格控制

四、蛋白质药物理化性质鉴定

（一）特异性鉴别试验

原液和成品

免疫印迹法

WesternBlot、DotBlot

应该阳性

（二）相对分子量测定

还原型SDS-PAGE（见分生实验册51页、见药典附录ⅣC）、质谱法

1）理论值±

10%范围

2）批与批间一致

（三）等电点测定（见药典附录ⅣD）

IEF：

常规等电聚胶电泳（见分生实验册55-57页）

CE：

毛细管电泳

1）有明显主带

2）理论值±

0.5pH范围

3）批与批间一致

（四）紫外吸收光谱分析（见药典附录ⅡA）

紫外扫描

1）最大吸收波长与特征波长一致

（五）肽图分析（非常规）（见药典附录ⅧE）

溴化氰/胰蛋白酶裂解+HPLC/SDS-PAGE/CE/质谱法

1）有特征性图谱

（六）氨基酸组成分析（非常规）

HCl/NaOH水解（仅用于Trp测定）

+氨基酸自动分析仪

1）与理论值一致

（七）氨基酸序列分析（非常规）

N末端：

15个残基，

Edman化学降解法，蛋白质全自动测序仪

C末端：

1-3个残基

硫氰酸酯/羧肽酶降解法，RP-HPLC

（八）其它：

二硫键、糖基化（非常规）

五、残余杂质检测

（一）宿主相关杂质

宿主细胞蛋白含量：

（见药典附录ⅨC）

双抗体夹心ELISA：

用HAS作保护

宿主蛋白标准品：

中检所提供

1）大肠杆菌≤0.1%

2）CHO≤0.05%

宿主细胞DNA含量（见药典附录ⅨB）

DNA点印迹杂交法，地高辛标记

DNA标准品：

厂家提供

DNA含量≤10ng/剂量

细菌内毒素含量（见药典附录ⅫE凝胶限量实验）

鲎试剂分析法

　　鲎试剂标准品：

内毒素含量≤1０ＥＵ/剂量

（二）工艺相关杂质（见药典附录ⅨA）

如残余抗生素、IgG、蛋白A、小牛血清

（三）产品相关杂质

如多聚体、不同的PEG修饰产物

六、安全性及其它检测项目

（一）无菌试验

平皿法，需氧菌、厌氧菌、真菌、支原体

（二）热原试验

鲎试剂法或家兔法

（三）异常毒性试验

小鼠（1ml）或豚鼠（5ml），腹腔注射

（四）水分、装量、pH值

原液质量标准

⏹生物学活性、比活性（见药典附录ⅩC）

⏹蛋白质含量（见药典附录ⅥD）

⏹纯度：

≧95%，非还原SDS-PAGE法（见药典附录ⅣC）、HPLC法（见药典附录ⅢB）

⏹分子量：

还原型SDS-PAGE法（见药典附录ⅣC）、质谱法

⏹外源性DNA残留量：

≤10ng/剂量（见药典附录ⅨB）

⏹宿主蛋白残留量:

≦0.1%，0.05%（见药典附录ⅨC）

⏹残余抗生素：

不得检出（见药典附录ⅨA）

⏹细菌内毒素：

≤10EU/剂量（见药典附录ⅫE凝胶限量实验）

⏹结构确证：

等电点（见药典附录ⅣD）、紫外吸收光谱扫描（见药典附录ⅡA）、N末端15个氨基酸顺序、肽图（见药典附录ⅧE）、（氨基酸组成、）

成品质量标准

⏹鉴别试验：

免疫印迹法/斑点法，阳性

⏹物理检查：

外观、可见异物、装量

⏹化学检定：

水分、pH值

⏹生物学活性：

标示量的%范围

⏹无菌检查：

不得检出

⏹内毒素检查：

≤10EU/剂量

⏹异常毒性检查：

符合规定