1、(一) 检测意义 获取准确的效价信息,保证产品有效效价:有效性指标,反映药品效力生物学活性才能真实反映生物技术药效价原因:生物制品分子大、结构复杂、不稳定,使得重量与效价不一致生物制品技术药:单位(U、AU、IU)(二) 生物学活性测定方法分类1、动物基础的活性测定 离体动物器官法:脑利钠肽的兔主动脉 体内测定法: EPO的小鼠网织红细胞2、细胞基础的活性测定促细胞生长法:大多数细胞因子类抑制细胞生长法:细胞毒素、血管抑制剂间接保护细胞法:IFN保护WISH3、酶学基础的活性测定:重组酶类4、受体-配体、抗原-抗体结合基础的活性测定: 抗原决定簇与活性中心常不一致(三)生物学活性测定方法选择1
2、、细胞培养法离体器官法体内法2、细胞染色标记方法: MTT 3H-Thymidine 流式细胞仪 (测细胞周期、凋亡)3、定量法半定量法定性法4、生物学活性不一定与临床药效类型一致工艺稳定、测生物活性特别复杂时,可替代。 如rh-GH用HPLC(四)生物学活性测定(见药典附录C)1、样品:原液、成品2、方法:如上述(好好研究?)3、标准: 不同生物活性测定方法的规定标准 测定方法 规定标准动物基础的活性测定 70%-130%标示量细胞基础的活性测定 80%-120%标示量酶学基础的活性测定 85%-115%标示量结合反应的活性测定 85%-115%标示量(五)蛋白质药物的比活性(见分生实验册7
3、7页)?原液2、定义与计算: 比活性:单位重量蛋白的活性单位数(IU/mg)不小于。IU/mg4、意义:1)真实反映有活性的蛋白质所占的比例 厂家间、表达系统间、批间比较2)便于配制成品二 蛋白质纯度检查样品:方法:必须采用二种方法测定 非还原SDS-PAGE法 HPLC法标准:纯度均须达到95%或98%以上非还原SDS-PAGE法测定纯度(见药典附录C)SDS-PAGE:据分子大小分离样品处理:样品不加-ME或DTT 二硫键未打开,反映单体、二聚体或多聚体情况染色方法与上样量 银染: 5ug(检测限为1-10ng) 考马斯亮蓝R-250:10ug(检测限为0.1ug)定量方法:凝胶扫描无明显
4、杂带,纯度95%或98%HPLC法测纯度?(见药典附录B)分析柱:反相柱、离子柱、分子筛 应尽量采用反相柱或离子柱 应注明采用的分析柱性质上样量:5ug出峰时间正确 纯度:95%或98%三、蛋白质含量测定(见药典附录D)*Folin-酚试剂法(Lowry法):(见分生实验册67-73页) 简便、灵敏、优先采用,灵敏度:5-100ug/ml *染色法(Bradford法): 考马斯亮蓝G-250,简便灵敏, 25-200ug/mlBCA(二喹啉甲酸)法:操作简单,比Lowry法快4倍且更加方便,准确灵敏:20200 ug/ml,微量BCA的测定范围在0.510 ug/ml。经济适用 ,抗试剂干扰
5、能力比较强。紫外分光广度法: 用于原液比活性计算和成品规格控制四、蛋白质药物理化性质鉴定(一)特异性鉴别试验原液和成品免疫印迹法 Western Blot、 Dot Blot应该阳性(二)相对分子量测定还原型SDS-PAGE(见分生实验册51页、见药典附录C)、质谱法 1)理论值10%范围 2)批与批间一致(三)等电点测定(见药典附录D) IEF:常规等电聚胶电泳(见分生实验册55-57页) CE:毛细管电泳 1)有明显主带 2)理论值0.5pH范围 3)批与批间一致(四)紫外吸收光谱分析(见药典附录A)紫外扫描 1)最大吸收波长与特征波长一致(五)肽图分析(非常规)(见药典附录E) 溴化氰/
6、胰蛋白酶裂解+HPLC/ SDS-PAGE/CE/质谱法 1)有特征性图谱(六)氨基酸组成分析(非常规) HCl/NaOH水解(仅用于Trp测定) +氨基酸自动分析仪 1)与理论值一致(七)氨基酸序列分析(非常规) N末端: 15个残基, Edman化学降解法,蛋白质全自动测序仪 C末端: 1-3个残基 硫氰酸酯/羧肽酶降解法,RP-HPLC(八)其它:二硫键、糖基化(非常规)五、残余杂质检测(一)宿主相关杂质 宿主细胞蛋白含量:(见药典附录C) 双抗体夹心ELISA:用HAS作保护 宿主蛋白标准品:中检所提供 1)大肠杆菌0.1% 2)CHO 0.05%宿主细胞DNA含量(见药典附录B) D
7、NA点印迹杂交法,地高辛标记 DNA标准品:厂家提供 DNA含量10ng/剂量细菌内毒素含量(见药典附录E凝胶限量实验) 鲎试剂分析法鲎试剂标准品: 内毒素含量1/剂量(二)工艺相关杂质(见药典附录A) 如残余抗生素、IgG、蛋白A、小牛血清(三)产品相关杂质 如多聚体、不同的PEG修饰产物六、安全性及其它检测项目(一)无菌试验 平皿法,需氧菌、厌氧菌、真菌、支原体(二)热原试验 鲎试剂法或家兔法(三)异常毒性试验 小鼠(1ml)或豚鼠(5ml),腹腔注射(四)水分、装量、pH值原液质量标准生物学活性、比活性(见药典附录C)蛋白质含量(见药典附录D)纯度:95%,非还原SDS-PAGE法(见药
8、典附录C)、HPLC法(见药典附录B)分子量:还原型SDS-PAGE法(见药典附录C)、质谱法外源性DNA残留量: 10ng/剂量(见药典附录B)宿主蛋白残留量: 0.1%,0.05%(见药典附录C)残余抗生素:不得检出(见药典附录A)细菌内毒素:10EU/剂量(见药典附录E凝胶限量实验)结构确证:等电点(见药典附录D)、紫外吸收光谱扫描(见药典附录A)、N末端15个氨基酸顺序、肽图(见药典附录E)、(氨基酸组成、)成品质量标准鉴别试验:免疫印迹法/斑点法,阳性物理检查:外观、可见异物、装量化学检定:水分、pH值生物学活性:标示量的%范围无菌检查:不得检出内毒素检查: 10EU/剂量异常毒性检查:符合规定
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