第四章-超薄切片技术PPT格式课件下载.ppt

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由于水解酶的作用可引起细胞自溶,动物材料麻醉解剖戊二醛预固定（04，25）在预冷的玻板上细切（1mm3）戊二醛前固定（13h）漂洗（1030min）1锇酸后固定（12h）植物材料叶片宽1，长34，有时需脱蜡根茎果实1mm3单细胞：

洗去有机成分固定预包埋切块,3、取材方法,A、按样品类别分为：

B、按取材地点分为：

野外取材：

冰壶实验室室内取材,1、概念：

用化学或物理方法迅速将细胞、组织杀死,同时把从细胞间的联系到细胞器的分子结构等全部组织的活体形态、精细结构及其组成真实的保存下来.2、常用的固定方法化学方法：

锇酸（OsO4）,戊二醛（C5H8O2）,甲醛（HCHO），高锰酸钾KMnO4、重铬酸钾、丙烯醛物理方法：

冷冻，干燥，高温,二、固定,

（一）固定的基本知识,把细胞中的动态系统定格，要求生命过程立即停止,细胞和它周围组织中的半液体内含物立即凝固而不分解,接近细胞有机体的生活状态防止以后的制备过程中丢失或添加成分使其在电镜下有良好的电子反差,3、固定的目的,4、固定的标准细胞内膜结构线条清晰连续不断，细胞基质无明显溶泡和颗粒凝集,1）组成：

固定液：

固定剂缓冲液2）作用：

破坏细胞的酶活性系统稳定细胞物质成分，并保存之接近细胞生活状态的渗透压,使细胞不收缩或膨胀在组分的分子之间建立交联，提供骨架稳定细胞器的空间构型提供一定的电子反差,5、固定液的作用,1）渗透力强，穿透速度快，能迅速达到组织块的各部位，立即杀死细胞，以尽量减小死后变化2）稳定细胞成分和结构，使各种结构成分凝固或变性，以保证后续的各种处理中物质不溶解、不丢失3）使细胞不变形，保持各种结构生活时形状，不产生人工假象，以保证电镜图像的真实性。

4）能保存一定的酶活性,以供细胞化学的测定5）最好提供一定的反差,并有防腐作用,

（二）常用的固定剂,1、常用、理想固定剂应具备的条件,优点：

几乎和细胞内所有成分发生化学结合对氮具有较强亲和力，对含有蛋白质的细胞结构固定作用良好可保存脂肪,形成脂肪-锇复合物Z=76，增加膜的反差对磷脂蛋白、核蛋白保护很好,2、理想固定剂,1）锇酸（OsO4）,锇酸缺点：

不能固定糖元、碳水化合物、核酸，对微管固定效果差酶的钝化剂，不能用于细胞化学研究分子量大,渗透能力差，要求组织块小固定时间不宜过长可与乙醇、醛类氧化还原反应生成沉积有挥发性、剧毒,2）戊二醛（C5H8O2）,优点：

固定迅速，样品块可以大于1mm3能保存糖元、蛋白质、核蛋白，核酸，尤其对微管，内质网等固定效果最好，对细胞内结构有较强的亲和力可长时间固定（7天），适于野外取材不易使酶失活，适于细胞化学研究不挥发，但容易经皮肤吸收，对呼吸道粘膜有刺激性,双固定法：

指用戊二醛对样品前固定，漂洗后使用锇酸对样品进行后固定，这种使用两种化学试剂分别前后对样品进行固定的方法称为双固定法。

3）甲醛（HCHO）：

甲醛戊二醛滲透速度快、固定迅速，对酶活性的保护优于戊二醛，经济方便4）高锰酸钾（KMnO4）磷脂蛋白，对神经髓脂质很好，细胞膜性结构、叶绿素固定良好。

1、缓冲液：

一种仿效细胞外液成分，对细胞富有生理保护功能的溶液2、缓冲液主要作用维持稳定的pH值提供适当的渗透压提供适当的离子成分使样品不抽提，不沉淀3、附加剂：

调节渗透压，NaCL,CaCL2，蔗糖，葡萄糖,（三）缓冲液和附加剂,储备A液（0.2M）:

磷酸氢二钠（Na2HPO4.2H2O）35.61g加水定容1000ml储备B液（0.2M）:

磷酸二氢钠（NaH2PO4.2H2O）27.6g加水定容1000ml0.1M磷酸缓冲液（PBS），由储备A液（0.2M）和储备B液（0.2M）按上表比例合成，然后稀释定容到100ml。

优点：

对细胞无毒害，便宜，易于大量配置缺点：

易产生沉淀，不稳定，易受到细菌污染,磷酸盐缓冲液,4、常用缓冲液,巴比妥盐对锇酸适用，戊二醛不能，不长期保存二钾胂酸盐可长期保存，有毒，有臭味,（四）、固定,1、固定液的配制,单固定：

戊二醛或锇酸单次固定13小时双固定：

前固定（戊），漂洗，后固定（锇）多重固定：

用三种以上的固定剂对样品进行固定,2、固定的方法,1）按固定液的成分划分为：

2）按固定方式分为：

a.浸泡固定b.体外固定c.原位固定d.灌流固定,固定操作示意图,漂洗操作方法,1）固定液的浓度:

戊二醛1-5%,锇酸1-3%浓度低固定时间长细胞质的抽提,组织肿胀浓度高易损细胞微结构,OsO4或KMnO4可使蛋白质分子氧化而断裂2）固定液的渗透压：

渗透压低细胞器或整个细胞膨胀渗透压高细胞收缩3）pH值：

植物6.87.1,动7.27.44）固定的温度：

04但低温对细胞微丝、微管有害5）组织块的大小：

0.51mm36）固定液的用量，一般为组织块的500倍,3、固定注意事项：

三脱水（dehydrate）,1.定义：

用适当的有机溶剂取代组织和细胞中的游离态水分的过程。

2.脱水的原因：

包埋时一般使用非水溶性包埋剂，为了更好的包埋样品，提高包埋质量必须对样品脱水；

湿样品反差低、必须干燥；

含水样品在高真空下容易被破坏。

3.脱水的原则：

逐级梯度脱水（80%及以前4）305070809095（每次515min）100（23次，每次15min）100环氧丙烷（乙醇脱水时必须的一步骤,15min）,4.常用的脱水剂：

乙醇、丙酮、甲醇、乙二醇、聚乙二醇、环氧丙烷、包埋剂的单体。

5.脱水注意事项:

脱水要彻底更换液体动作要迅速脱水时间不宜过长固定后的样品要充分漂洗,附加步骤：

块染（BlockStaining）,块染：

在脱水前或脱水时对组织块进行的染色叫块染。

（在切成片之后的染色可称为“片染”）,脱水前染色：

双固定漂洗0.54%的醋酸双氧铀染色，1h,4脱水,脱水时染色：

脱水至70乙醇硝酸铅的70乙醇饱和溶液中2h,470乙醇漂洗继续脱水,四渗透与包埋,目的：

使包埋剂逐步渗透到组织细胞内部,以便与细胞外的包埋剂同时聚合，以保证切出优质的超薄切片。

步骤：

渗透，包埋，聚合

（一）、渗透（Infiltrate）渗透：

用另一种溶液或混合液逐渐取代组织内的脱水剂（或前介质），使细胞内外所有的空隙被渗透液填充。

脱水剂的比例包埋剂纯包埋剂脱水剂:

包埋剂3:

11:

3纯包埋剂,渗透时间表（小时）,包埋：

将渗透好的样品块放入到适当的包埋模具中，灌装上纯包埋剂包埋，经加温聚合形成一种固体基质，牢固地支撑整个细胞结构或组织，同时又不混乱其空间联系，制成适于机械切割的固体包埋块。

（二）、包埋（embedding）,1、包埋剂应具备的条件:

聚合有良好的切割性能，软硬度易调节粘度低,易渗透溶于脱水剂电子透明度好,并具有一定的反差聚合要充分、均匀，聚合温度要尽可能低本身无结构热稳定性好,可耐电子束轰击来源丰富，且各批号性能尽可能一致切片易染色,且对人体无害,2、常用包埋剂,1）甲基丙烯酸酯优点：

分子量小，粘度低,易渗透；

硬度易调节，切割性能好；

电子透明度高，电子反差好；

无毒性，便宜缺点：

聚合需要一定条件；

聚合后体积变化大，聚合损伤大；

不稳定，不耐电子束轰击易升华或蒸发2）聚酯树脂优点：

对样品损伤小，耐电子束的轰击，聚合收缩小，适合于细菌和植物组织等硬样品，缺点：

不稳定，易脆裂,3）水溶性包埋剂常用试剂：

乙二醇甲基丙烯酸酯（GMA），聚乙二醇（PEG）,甲基丙烯酸羟酸酯（HPMA）注意：

GMA需低温包埋，聚合时GMA和HPMA需紫外照射应用：

适于电镜细胞化学和组织化学研究4）环氧树脂类包埋剂：

特点：

聚合收缩率低，均匀，对样品损伤小，耐轰击，但切片困难，染色后反差小，有刺激作用常用试剂：

Epon-812,国产618，ERL4206Epon-812：

甘油多聚酯，低粘度，易渗透加速剂：

DMP-30（2，4，6三（二甲基氨基甲基苯酚）固化剂：

DDSA（十二烷基琥珀酸酐），块软MNA（六甲酸酐），块硬,3.常用配方：

Epon-812配方（1961，Luft）A液：

Epon8125mlDDSA8mlB液：

Epon8125mlMNA7ml最终：

A液13，B液15，DMP-3016滴（12%）夏天：

A：

B=2：

8（A多软）冬天：

B=1：

9（B多硬）,

（2）国产618配方:

61812ml+DDSA8ml+DBP（增塑剂，苯二甲酸二酯丁）0.61.6ml+DMP-300.20.4ml（13滴）（3）ERL-4206:

低粘度,易渗透4,包埋方法:

常规包埋:

定向包埋:

浅槽包埋、二次包埋、加条包埋,（三）、聚合,37（12h）45（1248h）60（2448h）（四）、注意事项1、一切器材均须烘干2、配制包埋剂时，逐项加入试剂并搅拌3、做好的包埋块置于干燥器中4、配制包埋剂不宜长时间存放，室温下也有一定程度聚合,渗透、包埋、聚合操作图,五超薄切片,A.载网:

1、作用：

承载样品,以便后续染色和观察2、分类从材料:

铜,镍,钼,金,银,铂,不锈钢,尼龙，碳形状上分:

圆型,蜂窝,正方形,长方形单孔型,狭逢型大小:

d=23mm,h=0.1mm目：

一英寸的线段上具有的孔的数目常用180230目（让70电子束通过）,

（一）、载网和支持膜,3、载网的特点大孔径（目数少）：

电子透过率高，支持性差，在低倍、分辨率低、大视野场合下使用小孔径（目数多）：

反之4、载网的清洗：

目的：

清洁，除去静电新网：

丙酮或乙醇浸洗，双水洗旧网：

溶膜酸碱,超声,离子蚀刻,点击返回,B.支持膜的制备1、特点:

本身无结构电子透明度高机械强度高,耐电子束的轰击,稳定性好不与样品发生反应厚度适中,1502、常用支持膜福尔莫瓦膜（Formvar）:

聚乙烯醇缩甲醛，0.2%0.5%氯仿溶液，机械强度高，制作简易火棉胶膜：

强度低，制作简易，12醋酸异戊酯溶液,帕罗丁膜：

30醋酸戊酯溶液，强度稍高于火棉胶膜碳膜：

机械轻度高，化学稳定好。

适于高分辨率样品，需专用仪器：

真空喷镀仪复合膜：

有机膜碳膜（50100）微孔支持膜（微