1、由于水解酶的作用可引起细胞自溶,动物材料麻醉解剖 戊二醛预固定(04,25)在预冷的玻板上细切(1mm3)戊二醛前固定(13h)漂洗(1030min)1锇酸后固定(12h)植物材料叶片宽1,长34,有时需脱蜡根茎果实1mm3单细胞:洗去有机成分固定预包埋切块,3、取材方法,A、按样品类别分为:,B、按取材地点分为:,野外取材:冰壶实验室室内取材,1、概念:用化学或物理方法迅速将细胞、组织杀死,同时把从细胞间的联系到细胞器的分子结构等全部组织的活体形态、精细结构及其组成真实的保存下来.2、常用的固定方法化学方法:锇酸(OsO4),戊二醛(C5H8O2),甲醛(HCHO),高锰酸钾KMnO4、重铬
2、酸钾、丙烯醛物理方法:冷冻,干燥,高温,二、固定,(一)固定的基本知识,把细胞中的动态系统定格,要求生命过 程立即停止,细胞和它周围组织中的半液 体内含物立即凝固而不分解,接近细胞有 机体的生活状态 防止以后的制备过程中丢失或添加成分 使其在电镜下有良好的电子反差,3、固定的目的,4、固定的标准 细胞内膜结构线条清晰连续不断,细胞基质无明显溶泡和颗粒凝集,1)组成:固定液:固定剂缓冲液2)作用:破坏细胞的酶活性系统 稳定细胞物质成分,并保存之 接近细胞生活状态的渗透压,使细胞不收缩或膨胀 在组分的分子之间建立交联,提供骨架稳定细胞器的空间构型 提供一定的电子反差,5、固定液的作用,1)渗透力强
3、,穿透速度快,能迅速达到组织块的各部位,立即杀死细胞,以尽量减小死后变化2)稳定细胞成分和结构,使各种结构成分凝固或变性,以保证后续的各种处理中物质不溶 解、不丢失3)使细胞不变形,保持各种结构生活时形状,不产生人工假象,以保证电镜图像的真实性。4)能保存一定的酶活性,以供细胞化学的测定5)最好提供一定的反差,并有防腐作用,(二)常用的固定剂,1、常用、理想固定剂应具备的条件,优点:几乎和细胞内所有成分发生化学结合 对氮具有较强亲和力,对含有蛋白质的细胞结构固定作 用良好 可保存脂肪,形成脂肪-锇复合物 Z=76,增加膜的反差 对磷脂蛋白、核蛋白保护很好,2、理想固定剂,1)锇酸(OsO4),
4、锇酸缺点:不能固定糖元、碳水化合物、核酸,对微管固定效果差 酶的钝化剂,不能用于细胞化学研究 分子量大,渗透能力差,要求组织块小 固定时间不宜过长 可与乙醇、醛类氧化还原反应生成沉积 有挥发性、剧毒,2)戊二醛(C5H8O2),优点:,固定迅速,样品块可以大于1mm3 能保存糖元、蛋白质、核蛋白,核酸,尤其对微 管,内质网等固定效果最好,对细胞内结构有较 强的亲和力 可长时间固定(7天),适于野外取材 不易使酶失活,适于细胞化学研究 不挥发,但容易经皮肤吸收,对呼吸道粘膜有 刺激性,双固定法:指用戊二醛对样品前固定,漂洗后使用锇酸对样品进行后固定,这种使用两种化学试剂分别前后对样品进行固定的方
5、法称为双固定法。,3)甲醛(HCHO):甲醛戊二醛 滲透速度快、固定迅速,对酶活 性的保护优于 戊二醛,经济方便4)高锰酸钾(KMnO4)磷脂蛋白,对神经髓脂质很好,细胞膜性结 构、叶绿素固定良好。,1、缓冲液:一种仿效细胞外液成分,对细胞富有生理保护功能的溶液2、缓冲液主要作用 维持稳定的pH值 提供适当的渗透压 提供适当的离子成分使样品不抽提,不沉淀3、附加剂:调节渗透压,NaCL,CaCL2,蔗糖,葡萄糖,(三)缓冲液和附加剂,储备A液(0.2M):磷酸氢二钠(Na2HPO4.2H2O)35.61g加水定容1000ml储备B液(0.2M):磷酸二氢钠(NaH2PO4.2H2O)27.6g
6、加水定容1000ml 0.1M磷酸缓冲液(PBS),由储备A液(0.2M)和储备B液(0.2M)按上表比例合成,然后稀释定容到100ml。优点:对细胞无毒害,便宜,易于大量配置 缺点:易产生沉淀,不稳定,易受到细菌污染,磷酸盐缓冲液,4、常用缓冲液,巴比妥盐 对锇酸适用,戊二醛不能,不长期保存二钾胂酸盐 可长期保存,有毒,有臭味,(四)、固定,1、固定液的配制,单固定:戊二醛或锇酸单次固定13小时双固定:前固定(戊),漂洗,后固定(锇)多重固定:用三种以上的固定剂对样品进行固定,2、固定的方法,1)按固定液的成分划分为:,2)按固定方式分为:,a.浸泡固定 b.体外固定 c.原位固定 d.灌流
7、固定,固定操作示意图,漂洗操作方法,1)固定液的浓度:戊二醛1-5%,锇酸1-3%浓度低固定时间长细胞质的抽提,组织肿胀 浓度高易损细胞微结构,OsO4或KMnO4可使蛋 白质分子氧化而断裂2)固定液的渗透压:渗透压低细胞器或整个细胞膨胀 渗透压高细胞收缩3)pH值:植物6.87.1,动7.27.44)固定的温度:04 但低温对细胞微丝、微管有害5)组织块的大小:0.51mm36)固定液的用量,一般为组织块的500倍,3、固定注意事项:,三 脱水(dehydrate),1.定义:用适当的有机溶剂取代组织和细胞中的 游离态水分的过程。2.脱水的原因:包埋时一般使用非水溶性包埋剂,为了更好的包埋样
8、 品,提高包埋质量必须对样品脱水;湿样品反差低、必须干 燥;含水样品在高真空下容易被破坏。3.脱水的原则:逐级梯度脱水(80%及以前4)305070809095(每次5 15min)100(23次,每次15min)100环 氧丙烷(乙醇脱水时必须的一步骤,15min),4.常用的脱水剂:乙醇、丙酮、甲醇、乙二醇、聚乙二醇、环氧丙烷、包埋剂的单体。5.脱水注意事项:脱水要彻底 更换液体动作要迅速 脱水时间不宜过长 固定后的 样品要充分漂洗,附加步骤:块染(Block Staining),块染:在脱水前或脱水时对组织块进行的染色叫块染。(在切成片之后的染色可称为“片染”),脱水前染色:双固定 漂洗
9、 0.54%的醋酸双氧铀染色,1h,4脱水,脱水时染色:脱水至70乙醇 硝酸铅的70乙醇饱和溶液中2h,4 70乙醇漂洗 继续脱水,四 渗透与包埋,目的:使包埋剂逐步渗透到组织细胞内部,以便与 细胞外的包埋剂同时聚合,以保证切出优质 的超薄切片。步骤:渗透,包埋,聚合(一)、渗透(Infiltrate)渗透:用另一种溶液或混合液逐渐取代组织内的脱 水剂(或前介质),使细胞内外所有的空隙 被渗透液填充。脱水剂的比例包埋剂纯包埋剂 脱水剂:包埋剂3:1 1:3 纯包埋剂,渗透时间表(小时),包埋:将渗透好的样品块放入到适当的包埋模具中,灌装上纯包埋剂包埋,经加温聚合形成一种固体基质,牢固地支撑整个
10、细胞结构或组织,同时又不混乱其空间联系,制成适于机械切割的固体包埋块。,(二)、包埋(embedding),1、包埋剂应具备的条件:,聚合有良好的切割性能,软硬度易调节 粘度低,易渗透 溶于脱水剂 电子透明度好,并具有一定的反差 聚合要充分、均匀,聚合温度要尽可能低 本身无结构 热稳定性好,可耐电子束轰击 来源丰富,且各批号性能尽可能一致 切片易染色,且对人体无害,2、常用包埋剂,1)甲基丙烯酸酯 优点:分子量小,粘度低,易渗透;,硬度易调节,切割性能好;电子透明度高,电子反差好;无毒性,便宜 缺点:聚合需要一定条件;聚合后体积变化大,聚合损伤大;不稳定,不耐电子束轰击易升华或蒸发2)聚酯树脂
11、 优点:对样品损伤小,耐电子束的轰击,聚合收缩小,适合于细菌和植物组织等硬样品,缺点:不稳定,易脆裂,3)水溶性包埋剂 常用试剂:乙二醇甲基丙烯酸酯(GMA),聚乙二醇(PEG),甲基丙烯酸羟酸酯(HPMA)注意:GMA需低温包埋,聚合时GMA和HPMA需 紫外照射 应用:适于电镜细胞化学和组织化学研究4)环氧树脂类包埋剂:特点:聚合收缩率低,均匀,对样品损伤小,耐轰 击,但切片困难,染色后反差小,有刺激作用 常用试剂:Epon-812,国产618,ERL4206 Epon-812:甘油多聚酯,低粘度,易渗透 加速剂:DMP-30(2,4,6三(二甲基氨 基甲基苯酚)固化剂:DDSA(十二烷基
12、琥珀酸酐),块软 MNA(六甲酸酐),块硬,3.常用配方:Epon-812配方(1961,Luft)A液:Epon812 5ml DDSA 8ml B液:Epon812 5ml MNA 7ml 最终:A液13,B液15,DMP-30 16滴(12%)夏天:A:B=2:8(A多软)冬天:B=1:9(B多硬),(2)国产618配方:618 12ml+DDSA 8ml+DBP(增塑剂,苯二甲酸二酯丁)0.61.6ml+DMP-30 0.20.4ml(13滴)(3)ERL-4206:低粘度,易渗透4,包埋方法:常规包埋:定向包埋:浅槽包埋、二次包埋、加条包埋,(三)、聚合,37(12h)45(1248
13、h)60(2448h)(四)、注意事项 1、一切器材均须烘干 2、配制包埋剂时,逐项加入试剂并搅拌 3、做好的包埋块置于干燥器中 4、配制包埋剂不宜长时间存放,室温下 也有一定程度聚合,渗透、包埋、聚合操作图,五 超薄切片,A.载网:1、作用:承载样品,以便后续染色和观察 2、分类 从材料:铜,镍,钼,金,银,铂,不锈钢,尼龙,碳 形状上分:圆型,蜂窝,正方形,长方形 单孔型,狭逢型 大小:d=23mm,h=0.1mm 目:一英寸的线段上具有的孔的数目 常用180230目(让70电子束通过),(一)、载网和支持膜,3、载网的特点 大孔径(目数少):电子透过率高,支持性差,在低倍、分辨率低、大视
14、野 场合下使用 小孔径(目数多):反之4、载网的清洗:目的:清洁,除去静电 新网:丙酮或乙醇浸洗,双水洗 旧网:溶膜酸碱,超声,离子蚀刻,点击返回,B.支持膜的制备 1、特点:本身无结构 电子透明度高 机械强度高,耐电子束的轰击,稳定性好 不与样品发生反应 厚度适中,150 2、常用支持膜 福尔莫瓦膜(Formvar):聚乙烯醇缩甲醛,0.2%0.5%氯仿溶液,机械强度高,制作简易 火棉胶膜:强度低,制作简易,12 醋酸异戊酯溶液,帕罗丁膜:30醋酸戊酯溶液,强度稍 高于火棉胶膜 碳膜:机械轻度高,化学稳定好。适于 高分辨率样品,需专用仪器:真空喷镀仪 复合膜:有机膜碳膜(50100)微孔支持膜(微
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