第四章-超薄切片技术PPT格式课件下载.ppt

1、由于水解酶的作用可引起细胞自溶,动物材料麻醉解剖 戊二醛预固定（04，25）在预冷的玻板上细切（1mm3）戊二醛前固定（13h）漂洗（1030min）1锇酸后固定（12h）植物材料叶片宽1，长34，有时需脱蜡根茎果实1mm3单细胞：洗去有机成分固定预包埋切块,3、取材方法,A、按样品类别分为：,B、按取材地点分为：,野外取材：冰壶实验室室内取材,1、概念：用化学或物理方法迅速将细胞、组织杀死,同时把从细胞间的联系到细胞器的分子结构等全部组织的活体形态、精细结构及其组成真实的保存下来.2、常用的固定方法化学方法：锇酸（OsO4）,戊二醛（C5H8O2）,甲醛（HCHO），高锰酸钾KMnO4、重铬

2、酸钾、丙烯醛物理方法：冷冻，干燥，高温,二、固定,（一）固定的基本知识,把细胞中的动态系统定格，要求生命过 程立即停止,细胞和它周围组织中的半液 体内含物立即凝固而不分解,接近细胞有 机体的生活状态 防止以后的制备过程中丢失或添加成分 使其在电镜下有良好的电子反差,3、固定的目的,4、固定的标准 细胞内膜结构线条清晰连续不断，细胞基质无明显溶泡和颗粒凝集,1）组成：固定液：固定剂缓冲液2）作用：破坏细胞的酶活性系统 稳定细胞物质成分，并保存之 接近细胞生活状态的渗透压,使细胞不收缩或膨胀 在组分的分子之间建立交联，提供骨架稳定细胞器的空间构型 提供一定的电子反差,5、固定液的作用,1）渗透力强

3、，穿透速度快，能迅速达到组织块的各部位，立即杀死细胞，以尽量减小死后变化2）稳定细胞成分和结构，使各种结构成分凝固或变性，以保证后续的各种处理中物质不溶 解、不丢失3）使细胞不变形，保持各种结构生活时形状，不产生人工假象，以保证电镜图像的真实性。4）能保存一定的酶活性,以供细胞化学的测定5）最好提供一定的反差,并有防腐作用,（二）常用的固定剂,1、常用、理想固定剂应具备的条件,优点：几乎和细胞内所有成分发生化学结合 对氮具有较强亲和力，对含有蛋白质的细胞结构固定作 用良好 可保存脂肪,形成脂肪-锇复合物 Z=76，增加膜的反差 对磷脂蛋白、核蛋白保护很好,2、理想固定剂,1）锇酸（OsO4）,

4、锇酸缺点：不能固定糖元、碳水化合物、核酸，对微管固定效果差 酶的钝化剂，不能用于细胞化学研究 分子量大,渗透能力差，要求组织块小 固定时间不宜过长 可与乙醇、醛类氧化还原反应生成沉积 有挥发性、剧毒,2）戊二醛（C5H8O2）,优点：,固定迅速，样品块可以大于1mm3 能保存糖元、蛋白质、核蛋白，核酸，尤其对微 管，内质网等固定效果最好，对细胞内结构有较 强的亲和力 可长时间固定（7天），适于野外取材 不易使酶失活，适于细胞化学研究 不挥发，但容易经皮肤吸收，对呼吸道粘膜有 刺激性,双固定法：指用戊二醛对样品前固定，漂洗后使用锇酸对样品进行后固定，这种使用两种化学试剂分别前后对样品进行固定的方

5、法称为双固定法。,3）甲醛（HCHO）：甲醛戊二醛 滲透速度快、固定迅速，对酶活 性的保护优于 戊二醛，经济方便4）高锰酸钾（KMnO4）磷脂蛋白，对神经髓脂质很好，细胞膜性结 构、叶绿素固定良好。,1、缓冲液：一种仿效细胞外液成分，对细胞富有生理保护功能的溶液2、缓冲液主要作用 维持稳定的pH值 提供适当的渗透压 提供适当的离子成分使样品不抽提，不沉淀3、附加剂：调节渗透压，NaCL,CaCL2，蔗糖，葡萄糖,（三）缓冲液和附加剂,储备A液（0.2M）:磷酸氢二钠（Na2HPO4.2H2O）35.61g加水定容1000ml储备B液（0.2M）:磷酸二氢钠（NaH2PO4.2H2O）27.6g

6、加水定容1000ml 0.1M磷酸缓冲液（PBS），由储备A液（0.2M）和储备B液（0.2M）按上表比例合成，然后稀释定容到100ml。优点：对细胞无毒害，便宜，易于大量配置 缺点：易产生沉淀，不稳定，易受到细菌污染,磷酸盐缓冲液,4、常用缓冲液,巴比妥盐 对锇酸适用，戊二醛不能，不长期保存二钾胂酸盐 可长期保存，有毒，有臭味,（四）、固定,1、固定液的配制,单固定：戊二醛或锇酸单次固定13小时双固定：前固定（戊），漂洗，后固定（锇）多重固定：用三种以上的固定剂对样品进行固定,2、固定的方法,1）按固定液的成分划分为：,2）按固定方式分为：,a.浸泡固定 b.体外固定 c.原位固定 d.灌流

7、固定,固定操作示意图,漂洗操作方法,1）固定液的浓度:戊二醛1-5%,锇酸1-3%浓度低固定时间长细胞质的抽提,组织肿胀 浓度高易损细胞微结构,OsO4或KMnO4可使蛋 白质分子氧化而断裂2）固定液的渗透压：渗透压低细胞器或整个细胞膨胀 渗透压高细胞收缩3）pH值：植物6.87.1,动7.27.44）固定的温度：04 但低温对细胞微丝、微管有害5）组织块的大小：0.51mm36）固定液的用量，一般为组织块的500倍,3、固定注意事项：,三 脱水（dehydrate）,1.定义：用适当的有机溶剂取代组织和细胞中的 游离态水分的过程。2.脱水的原因：包埋时一般使用非水溶性包埋剂，为了更好的包埋样

8、 品，提高包埋质量必须对样品脱水；湿样品反差低、必须干 燥；含水样品在高真空下容易被破坏。3.脱水的原则：逐级梯度脱水（80%及以前4）305070809095（每次5 15min）100（23次，每次15min）100环 氧丙烷（乙醇脱水时必须的一步骤,15min）,4.常用的脱水剂：乙醇、丙酮、甲醇、乙二醇、聚乙二醇、环氧丙烷、包埋剂的单体。5.脱水注意事项:脱水要彻底 更换液体动作要迅速 脱水时间不宜过长 固定后的 样品要充分漂洗,附加步骤：块染（Block Staining）,块染：在脱水前或脱水时对组织块进行的染色叫块染。（在切成片之后的染色可称为“片染”）,脱水前染色：双固定 漂洗

9、 0.54%的醋酸双氧铀染色，1h,4脱水,脱水时染色：脱水至70乙醇 硝酸铅的70乙醇饱和溶液中2h,4 70乙醇漂洗 继续脱水,四 渗透与包埋,目的：使包埋剂逐步渗透到组织细胞内部,以便与 细胞外的包埋剂同时聚合，以保证切出优质 的超薄切片。步骤：渗透，包埋，聚合（一）、渗透（Infiltrate）渗透：用另一种溶液或混合液逐渐取代组织内的脱 水剂（或前介质），使细胞内外所有的空隙 被渗透液填充。脱水剂的比例包埋剂纯包埋剂 脱水剂:包埋剂3:1 1:3 纯包埋剂,渗透时间表（小时）,包埋：将渗透好的样品块放入到适当的包埋模具中，灌装上纯包埋剂包埋，经加温聚合形成一种固体基质，牢固地支撑整个

10、细胞结构或组织，同时又不混乱其空间联系，制成适于机械切割的固体包埋块。,（二）、包埋（embedding）,1、包埋剂应具备的条件:,聚合有良好的切割性能，软硬度易调节 粘度低,易渗透 溶于脱水剂 电子透明度好,并具有一定的反差 聚合要充分、均匀，聚合温度要尽可能低 本身无结构 热稳定性好,可耐电子束轰击 来源丰富，且各批号性能尽可能一致 切片易染色,且对人体无害,2、常用包埋剂,1）甲基丙烯酸酯 优点：分子量小，粘度低,易渗透；,硬度易调节，切割性能好；电子透明度高，电子反差好；无毒性，便宜 缺点：聚合需要一定条件；聚合后体积变化大，聚合损伤大；不稳定，不耐电子束轰击易升华或蒸发2）聚酯树脂

11、 优点：对样品损伤小，耐电子束的轰击，聚合收缩小，适合于细菌和植物组织等硬样品，缺点：不稳定，易脆裂,3）水溶性包埋剂 常用试剂：乙二醇甲基丙烯酸酯（GMA），聚乙二醇（PEG）,甲基丙烯酸羟酸酯（HPMA）注意：GMA需低温包埋，聚合时GMA和HPMA需 紫外照射 应用：适于电镜细胞化学和组织化学研究4）环氧树脂类包埋剂：特点：聚合收缩率低，均匀，对样品损伤小，耐轰 击，但切片困难，染色后反差小，有刺激作用 常用试剂：Epon-812,国产618，ERL4206 Epon-812：甘油多聚酯，低粘度，易渗透 加速剂：DMP-30（2，4，6三（二甲基氨 基甲基苯酚）固化剂：DDSA（十二烷基

12、琥珀酸酐），块软 MNA（六甲酸酐），块硬,3.常用配方：Epon-812配方（1961，Luft）A液：Epon812 5ml DDSA 8ml B液：Epon812 5ml MNA 7ml 最终：A液13，B液15，DMP-30 16滴（12%）夏天：A：B=2：8（A多软）冬天：B=1：9（B多硬）,（2）国产618配方:618 12ml+DDSA 8ml+DBP（增塑剂，苯二甲酸二酯丁）0.61.6ml+DMP-30 0.20.4ml（13滴）（3）ERL-4206:低粘度,易渗透4,包埋方法:常规包埋:定向包埋:浅槽包埋、二次包埋、加条包埋,（三）、聚合,37（12h）45（1248

13、h）60（2448h）（四）、注意事项 1、一切器材均须烘干 2、配制包埋剂时，逐项加入试剂并搅拌 3、做好的包埋块置于干燥器中 4、配制包埋剂不宜长时间存放，室温下 也有一定程度聚合,渗透、包埋、聚合操作图,五 超薄切片,A.载网:1、作用：承载样品,以便后续染色和观察 2、分类 从材料:铜,镍,钼,金,银,铂,不锈钢,尼龙，碳 形状上分:圆型,蜂窝,正方形,长方形 单孔型,狭逢型 大小:d=23mm,h=0.1mm 目：一英寸的线段上具有的孔的数目 常用180230目（让70电子束通过）,（一）、载网和支持膜,3、载网的特点 大孔径（目数少）：电子透过率高，支持性差，在低倍、分辨率低、大视

14、野 场合下使用 小孔径（目数多）：反之4、载网的清洗：目的：清洁，除去静电 新网：丙酮或乙醇浸洗，双水洗 旧网：溶膜酸碱,超声,离子蚀刻,点击返回,B.支持膜的制备 1、特点:本身无结构 电子透明度高 机械强度高,耐电子束的轰击,稳定性好 不与样品发生反应 厚度适中,150 2、常用支持膜 福尔莫瓦膜（Formvar）:聚乙烯醇缩甲醛，0.2%0.5%氯仿溶液，机械强度高，制作简易 火棉胶膜：强度低，制作简易，12 醋酸异戊酯溶液,帕罗丁膜：30醋酸戊酯溶液，强度稍 高于火棉胶膜 碳膜：机械轻度高，化学稳定好。适于 高分辨率样品，需专用仪器：真空喷镀仪 复合膜：有机膜碳膜（50100）微孔支持膜（微