结直肠癌相关生物钟通路遗传变异与环境因素交互作用的研究课题申请书.docx
《结直肠癌相关生物钟通路遗传变异与环境因素交互作用的研究课题申请书.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《结直肠癌相关生物钟通路遗传变异与环境因素交互作用的研究课题申请书.docx（21页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
结直肠癌相关生物钟通路遗传变异与环境因素交互作用的研究课题申请书
基本信息
项目信息
项目名称
结直肠癌相关生物钟通路遗传变异与环境因素交互作用的研究
项目类别
育苗工程（自然科学）
研究类型
基础研究
申请金额
5（万元）
学科一
预防医学与公共卫生学-流行病学
学科二
学科三
计划开始日期
计划完成日期
所属学校
预期成果形式
论文
合作单位
合作单位名称
联系人
联系电话
通讯地址
负责人信息
姓名
性别
民族
出生年月
学历
学位
职称
职务
教师
办公电话
手机
一级学科
预防医学与公共卫生学
二级学科
流行病学
电子邮件
身份证号
人才层次
研究专长
肿瘤分子流行病学
摘要
现有研究提示生物钟通路可能作为中间桥梁参与了环境因素促进结直肠癌发生发展的过程，但生物钟通路的遗传变异与环境因素的交互对结直肠癌发生发展的影响如何尚有待于研究。
本研究拟采用病例对照研究及单纯病例研究设计，运用TaqMan荧光定量PCR技术检测生物钟通路关键基因CLOCK、BMAL1、PER2的标签SNP，对生物钟通路关键基因的遗传变异与结直肠癌发生、转移风险的相关性进行全面分析，应用参数法与非参数法有机结合的统计策略重点探讨基因－环境交互对结直肠癌发生、转移的影响。
本研究将进一步加深对环境因素影响结直肠癌发生发展机制的认识，具有一定的理论意义。
所识别的与结直肠癌发生、转移相关的遗传变异及基因－环境交互作用可为结直肠癌高风险个体的筛查和肿瘤患者的预后监测提供科学依据。
关键字
结直肠癌，生物钟，遗传变异，环境因素，交互作用
项目组成员
总数（含负责人）
高级
中级
初级
博士
硕士
学士
5
1
1
3
2
0
3
姓名
性别
出生年月
学位
职称
项目分工
工作单位
研究领域
郜艳晖
女
1973.9
博士
副高级
协助设计及统计分析
广东药学院
遗传统计学
叶新
男
1985.4
学士
初级及以下
实验室检测及统计分析
广东药学院
肿瘤分子流行病学
刘珺
女
1984.7
学士
初级及以下
统计分析
广东药学院
流行病学
王小丽
女
1986.10
学士
初级及以下
实验室检测
广东药学院
肿瘤分子流行病学
经费申请表（金额单位：
万元）
预算科目
省教育厅支持经费
备注（计算依据与说明）
一、科研业务费
0.2000万元
1、测试、计算、分析
0.0000万元
2、会议费、差旅费
0.0000万元
3、出版物、文献、信息传播
0.2000万元
版面费（中文2000元/篇）
4、其他
0.0000万元
二、试验材料费
4.8000万元
1、原材料、试剂、药品购置费
4.8000万元
探针引物4万元，化学试剂及耗材0.8万元
2、其他
0.0000万元
三、仪器设备费
0.0000万元
1、购置
0.0000万元
2、试制
0.0000万元
四、劳务费
0.0000万元
五、其他费用
0.0000万元
1、
万元
2、
万元
3、
万元
4、
万元
合计
5.0000
与本项目有关的其他经费来源
其他计划资助经费
万元
学校配套
万元
其他经费资助
万元
其他经费合计
0.0000万元
进度计划
序号
起止时间
阶段性研究工作进展
阶段性目标
1
2012.1-2012.3
实验准备阶段：
挑选SNP位点、定制SNP探针引物、购买试剂耗材、样本整理、预实验
完成实验准备工作
2
2012.4-2012.9
实验阶段：
SNP基因型检测
完成实验室检测
3
2012.10-2013.1
资料整理与数据分析：
SNP与结直肠癌发生、转移风险相关性分析；生物信息学分析。
完成统计分析及生物信息分析
4
2013.2-2013.6
撰写论文及总结报告
完成总结报告及论文
预期成果
论文（篇）
总数
2
其中：
CSCD核心期刊
1
三大索引收录
1
专著（部）
0
研究报告（篇）
0
专利（件）
数量（件）
申请
0
授权
0
其中发明专利
申请
0
授权
0
鉴定成果（项）
0
软件登记（项）
0
新产品（种）（或新装备、新药等）
0
新技术（项）（或新工艺等）
0
其他
0
申请书正文
一、立项依据
结直肠癌是严重威胁人类健康的常见恶性肿瘤之一，全球每年有超过100万例新发病例，并且有约60万例患者死于结直肠癌[1]。
我国是传统的结直肠癌低发国，但近年来由于生活方式的“西方化”伴随着环境危险因素的暴露，结直肠癌的发病率呈现持续上升趋势。
结直肠癌在我国城市和农村分别以每年31.95%和8.15%的速度递增，成为我国近十五年期间发病率上升速度最快的恶性肿瘤之一[2]。
尽管结直肠癌的诊疗技术在近年有显著进展，但由于结直肠癌起病隐匿，约有60%的患者在初次诊断时已处于中晚期，结直肠癌总体死亡率高达50%[3]。
结直肠癌已成为严重威胁我国居民生命健康的重大公共卫生问题，因此积极探索结直肠癌的发病机制对于控制其流行、减轻其疾病负担具有重要的现实意义。
国内外研究结果均证实了环境因素如高脂低纤维饮食、缺乏体力活动、肥胖等可以显著增加结直肠癌发病风险[4]。
但关于环境因素如何促进结直肠癌发生发展的机制我们尚未清楚，阐明其中的机制对结直肠癌的防治工作将具有重大的实际意义。
最近研究发现，某些环境因素比如夜间光照、高脂肪饮食、缺乏体力活动等可以通过影响生物的昼夜节律控制系统而促进癌症的发生[5]，综合目前的研究来看，控制生物昼夜节律的生物钟系统有可能作为中间桥梁参与了环境因素促进结直肠癌发生发展的过程[6,7]，论述如下：
生物昼夜节律（circadianrhythm）是人类在长期生物进化过程中形成的，其发生的物质基础是生物钟系统。
生物钟系统由一系列呈节律性表达的生物钟基因及其编码的蛋白质组成，构成一个或多个转录—翻译反馈回路，以近于24小时的周期进行振荡[8]。
在生物节律调节的核心环路中，钟基因编码蛋白CLOCK与BMAL1结合形成的CLOCK/BMAL1异二聚体通过与PER1、PER2、PER3，CRY1、CRY2等钟基因启动子部位的E-BOX结合，激活这些基因的转录，而生成的PER及CRY蛋白反馈性的抑制钟基因CLOCK与BMAL1的转录[9]。
钟控基因（处于钟基因下游，受钟基因调节而表现为节律性表达的基因）含有可供CLOCK或BMAL1结合的E-BOX。
CLOCK/BMAL1异二聚体也可与钟控基因的E-BOX结合而促进钟控基因的转录，而钟基因PER1、PER2、PER3、CRY1、CRY2等则可通过抑制CLOCK或BMAL1转录进而间接抑制钟控基因的转录。
在这个调节环路中，CLOCK和BMAL1为钟基因的转录提供了最基本的动力，而PER2的负反馈调节则是其中最重要的负反馈机制[9]。
生物钟系统虽然作为维持生命的基本系统保持高度的稳定性，但光照、激素水平、饮食、锻炼等因素可诱导外周组织中的生物钟重置[10,11]。
动物实验研究发现，高脂肪饮食会改变生物钟系统的外周生物钟的调控功能，进而扰乱体内的生物信号节律[12,13]。
同时有研究也发现规律的体育锻炼对于维持机体生物钟功能的稳定起到了十分重要的作用[14]。
这表明环境因素可通过调节生物钟的功能进而改变机体的生物钟节律。
而多个研究已表明机体生物节律的改变通过多种途径增加肿瘤的发病风险。
例如近年来针对昼夜节律变化与乳腺癌发病风险之间的研究就表明，夜班或轮班工作致使昼夜节律的混乱，导致乳腺癌的发病风险提高10%-60%，其分子机制可能为夜间照明的刺激，影响生物钟系统对褪黑素的分泌水平的昼夜调节，褪黑激素的夜间分泌减少导致雌激素分泌的增多，从而增加乳腺癌的患病风险[15,16]。
近年来学者对生物钟基因在前列腺癌发病过程中的作用也进行了探讨，认为生物钟基因遗传变异通过对激素水平的调节来影响前列腺癌的发病风险[17,18]。
同时，研究还发现许多调控细胞增殖的基因为钟控基因，比如原癌基因、抑癌基因等，生物钟通路的遗传变异可通过影响钟基因的表达或编码产物的功能进而干扰钟控基因的表达，直接或间接的参与多种肿瘤的发生、发展[7,15]。
而在结直肠癌的研究中则观察到，患者体内与结直肠癌发病风险密切相关的生长激素（GrowthHormone,GH）分泌的昼夜节律会发生改变，尤其是在肿瘤较大或已有肝转移、一般情况较差的肿瘤患者中，这种节律的改变表现得尤为明显[19]。
这表明昼夜节律的改变可能会影响GH分泌的节律，进而增加结直肠癌发生的风险。
更重要的是，最近的一项研究发现，结直肠癌组织中的生物钟通路关键基因BMAL1、PER2的表达异常与结直肠癌发生、发展密切相关[20]。
综合这些研究结果，我们提出研究假设：
在结直肠癌的发病机制中可能存在着环境因素通过影响生物钟系统的功能从而促进结直肠癌发生发展的这一通路，并且生物节律调节环路上的关键基因CLOCK、BMAL1、PER2的遗传变异和环境因素一起共同影响结直肠癌的发病风险。
为此，我们拟综合国内外最新的研究成果，围绕“结直肠癌相关生物钟通路关键基因遗传变异与环境因素交互作用的研究”这一中心议题，采用病例对照研究及单纯病例研究设计，应用标签SNP（tagSNP）策略，分析生物钟通路关键基因CLOCK、BMAL1、PER2遗传变异与结直肠癌发生、转移风险的相关性，并应用参数法与非参数法有机结合的统计学策略重点探讨遗传变异之间及其与环境因素之间的交互作用对结直肠癌发生、转移的影响；并从生物信息学角度出发，对鉴定得到的与结直肠癌相关的遗传变异进行生物学机制的初步探讨。
本研究成果将进一步加深对环境因素影响结直肠癌发生发展机制的认识，具有一定的理论意义。
所识别的与结直肠癌发生、转移相关的遗传变异及基因–基因、基因–环境交互模型有可能应用于高风险个体的筛查和结直肠癌患者的预后监测。
参考文献
1.FerlayJ,ShinH-R,BrayF,etal.Estimatesofworldwideburdenofcancerin2008:
GLOBOCAN2008.InternationalJournalofCancer2010;127:
2893-2917.
2.中华人民共和国统计局.2010中国卫生统计年鉴.
3.AmericanCancerSociety.Colorectalcancerfactsandfigures2008-2010.Availableat:
http:
//www.cancer.org/downloads/STT/F861708finalforweb.pdf.
4.KhanN,AfaqF,MukhtarH.Lifestyleasriskfactorforcancer:
Evidencefromhumanstudies.CancerLett2010;293:
133-143.
5.GimbleJM,SuttonGM,PtitsynAAetal.Circadianrhythmsinadiposetissue:
anupdate.CurrOpinClinNutrMetabCare2011Oct7.[Epubaheadofprint]
6.TeboulM,GuillaumondF,Grechez-CassiauA,DelaunayF.Thenuclearhormonereceptorfamilyroundtheclock.MolEndocrinol2008;22:
2573-2582.
7.YuEA,WeaverDR.Disruptingthecircadianclock:
gene-specificeffectsonaging,cancer,andotherphenotypes.Aging（AlbanyNY）2011;3:
479-493.
8.MazzoccoliG.Thetimingclockworkoflife.JBiolRegulHomeostAgents2011;25:
137-143.
9.ZhangL,JonesCR,PtacekLJ,FuYH.Thegeneticsofthehumancircadianclock.AdvGenet2011;74:
231-247.
10.Orozco-SolisR,MatosRJ,LopesdeSouzaS,etal.Perinatalnutrientrestrictioninduceslong-lastingalterationsinthecircadianexpressionpatternofgenesregulatingfoodintakeandenergymetabolism.IntJObes（Lond）2011;35:
990-1000.
11.SharmaM,MajumdarPK.Occupationallifestylediseases:
Anemergingissue.IndianJOccupEnvironMed2009;13:
109-112.
12.KohsakaA,LaposkyAD,RamseyKM,etal.High-fatdietdisruptsbehavioralandmolecularcircadianrhythmsinmice.CellMetab2007;6:
414-421.
13.HoogerwerfWA,HellmichHL,CornelissenG,etal.Clockgeneexpressioninthemurinegastrointestinaltract:
endogenousrhythmicityandeffectsofafeedingregimen.Gastroenterology2007;133:
1250-1260.
14.AtkinsonG,EdwardsB,ReillyT,WaterhouseJ.Exerciseasasynchroniserofhumancircadianrhythms:
anupdateanddiscussionofthemethodologicalproblems.EurJApplPhysiol2007;99:
331-341.
15.RanaS,MahmoodS.Circadianrhythmanditsroleinmalignancy.JCircadianRhythms2010;8:
3.
16.SaharS,Sassone-CorsiP.Circadianclockandbreastcancer:
amolecularlink.CellCycle2007;6:
1329-1331.
17.CaoQ,GeryS,DashtiA,etal.Arolefortheclockgeneper1inprostatecancer.CancerRes2009;69:
7619-7625.
18.ZhuY,StevensRG,HoffmanAE,etal.Testingthecircadiangenehypothesisinprostatecancer:
apopulation-basedcase-controlstudy.CancerRes2009;69:
9315-9322.
19.SephtonSSD.Circadiandisruptionincancer:
aneuroendocrine-immunepathwayfromstresstodisease?
BrainBehavImmun2003;17:
321-328.
20.OshimaT,TakenoshitaS,AkaikeM,etal.Expressionofcircadiangenescorrelateswithlivermetastasisandoutcomesincolorectalcancer.OncolRep2011;25:
1439-1446.
二、研究方案
1.研究目标、研究内容和拟解决的关键问题
1.1研究目标
（1）探讨生物钟通路关键基因CLOCK、BMAL1、PER2遗传变异在中国人群结直肠癌发生、转移过程中的作用；
（2）阐明生物钟通路关键基因之间及基因与环境因素之间的交互作用对结直肠癌发生、转移的影响，以进一步揭示环境危险因素促进结直肠癌发生、发展的机制。
1.2研究内容
（1）CLOCK、BMAL1、PER2遗传变异与结直肠癌相关性的单位点分析：
采用病例对照研究和单纯病例研究设计，应用标签SNP选择策略，运用TaqMan荧光定量PCR技术检测生物钟通路关键基因CLOCK、BMAL1、PER2的标签SNP，采用χ2检验、logistic回归模型等方法分析各标签SNP基因型与结直肠癌发生、转移风险的统计学关联。
（2）CLOCK、BMAL1、PER2遗传变异之间及其与环境因素之间的交互作用分析：
采用参数法与非参数法有机结合的统计学策略，应用基于不同计算原理的统计方法包括多元logistic回归模型、多因子降维法、随机森林法等重点分析生物钟通路中基因–基因、基因–环境交互作用对结直肠癌发生、转移的影响。
（3）应用生物信息软件和数据库对与结直肠癌相关的遗传变异进行分子生物学机制上的初步分析：
F-SNP（http:
//compbio.cs.queensu.ca/F-SNP/）、SNPFunctionAnnotationPortal（http:
//brainarray.mbni.med.umich.edu/Brainarray/Database/SearchSNP/snpfunc.aspx）、FASTSNP（http:
//fastsnp.ibms.sinica.edu.tw/pages/input_CandidateGeneSearch.jsp）等综合性数据库整合了Ensembl、TFSearch、ESEfinder、SIFT、Polyphen等在内的多个生物信息软件和数据库，可对遗传变异在转录、内含子剪接、蛋白编码、翻译后修饰等水平的调控功能进行预测。
我们拟利用这些综合性生物信息数据库对鉴定的结直肠癌阳性关联位点的功能进行初步分析，为后续的验证性功能学实验提供进一步的线索。
1.3拟解决的关键问题
系统阐明生物钟通路关键基因的遗传变异之间及其与环境因素之间的交互作用对结直肠癌发生和转移风险的影响；从生物信息学角度出发，初步探讨与结直肠癌发生和转移相关的遗传变异的生物学机制。
2.拟采取的研究方法、技术路线、试验方案和可行性分析
2.1研究方法
（1）生物钟通路关键基因遗传变异与结直肠癌发生风险的关系：
采用病例对照研究方法，应用logistic回归模型等方法评估生物钟通路关键基因的标签SNP基因型与结直肠癌发生风险的统计学关联。
考虑到多重假设检验可能导致结果假阳性过高的问题，应用错误发现率方法（FalseDiscoveryRate,FDR）方法进行多重校正。
应用传统logistic回归、多因子降维法、随机森林法等分析基因与基因、基因与环境因素的交互作用。
（2）生物钟通路关键基因遗传变异与结直肠癌转移风险的关系：
采用单纯病例研究方法在上述的结直肠癌病例中分析生物钟通路关键基因遗传变异与结直肠癌转移程度的关联性分析，同样采用参数法结合非参数法的统计策略分析基因与基因、基因与环境之间交互在结直肠癌转移过程中的作用。
（3）应用F-SNP、SNPFunctionAnnotationPortal、FASTSNP等生物信息数据库对与结直肠癌发生、转移阳性关联SNP的功能进行初步的分析。
2.2技术路线及方案
技术路线
（1）样本量估算及研究对象的选择：
根据PowerProgramV3.0（http:
//www.mds.qmw.ac.uk/statgen/dcurtis/software.html）的计算结果，对于低频等位基因频率（minorallelefrequency,MAF）>0.1的遗传变异，800对的样本量可以在α=0.05的检验水平上提供至少90%的把握度检测出OR为1.5的统计学关联。
经过多年的合作和积累，项目申请者所属团队已经建立了较大规模的结直肠癌病例和对照遗传资源和临床与人口学资料库。
研究纳入的病例为经过组织病理学检验确诊的新发结直肠癌患者（含不同病理类型和临床分期）。
病例分期依据全国结直肠癌协作组改良Duckes分期标准，A期为肿瘤局限于肠壁；B期为肿瘤已侵及肠壁外但无淋巴结转移；C期为肿瘤有淋巴结转移，无论肿瘤是否局限于肠壁；D期为肿瘤有远处转移及邻近器官侵袭无法无安全切除。
研究排除同时罹患两种或以上的恶性肿瘤及有肿瘤既往史和由其他部位转移的肿瘤病例。
研究纳入的对照为与病例同地区的体检正常个体，并在性别和年龄上与病例组匹配。
本研究在研究对象自愿的情况下进行调查和采集血样，并签署知情同意书。
（本部分工作已经完成）
（2）资料的采集：
采用自制调查表，面询式调查各研究对象人口学及生活方式信息，包括性别、年龄、民族、受教育程度、结直肠癌家族史、疾病既往史、吸烟及饮酒等。
结直肠癌病例的相关临床病理信息通过查阅病历获得，包括肿瘤部位、大小、分期及分化程度等。
（本部分工作已经完成）
（3）标签SNP选择及基因分型：
利用人类基因组计划和国际单倍型计划HapMap（http:
//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/）公布的中国汉族居民（HCB）的基因型及连锁不平衡程度信息，采用HaploViewV4.2软件，设定参数R2>0.8为标准挑选标签SNP，以覆盖目标基因CLOCK、BMAL1、PER2所有MAF>0.1的SNP。
我们采用TaqMan探针荧光定量PCR对所选定的标签SNP进行基因型检测。
TaqMan荧光定量PCR技术成熟、结果可靠稳定、操作迅速，费用合理，完全可以满足我们对目标SNP基因型检测的需求，同时也可保证我们将基因分型成本控制在预算范围内。
（4）统计分析：
升级会员 