结直肠癌相关生物钟通路遗传变异与环境因素交互作用的研究课题申请书.docx

1、结直肠癌相关生物钟通路遗传变异与环境因素交互作用的研究课题申请书基本信息项目信息项目名称结直肠癌相关生物钟通路遗传变异与环境因素交互作用的研究项目类别育苗工程(自然科学)研究类型基础研究申请金额5(万元)学科一预防医学与公共卫生学 - 流行病学学科二学科三计划开始日期计划完成日期所属学校预期成果形式论文合作单位合作单位名称联系人联系电话通讯地址负责人信息姓 名性 别民 族出生年月学 历学 位职 称职 务教师办公电话手 机一级学科预防医学与公共卫生学二级学科流行病学电子邮件身份证号人才层次研究专长肿瘤分子流行病学摘要现有研究提示生物钟通路可能作为中间桥梁参与了环境因素促进结直肠癌发生发展的过程，

2、但生物钟通路的遗传变异与环境因素的交互对结直肠癌发生发展的影响如何尚有待于研究。本研究拟采用病例对照研究及单纯病例研究设计，运用TaqMan荧光定量PCR技术检测生物钟通路关键基因CLOCK、BMAL1、PER2的标签SNP，对生物钟通路关键基因的遗传变异与结直肠癌发生、转移风险的相关性进行全面分析，应用参数法与非参数法有机结合的统计策略重点探讨基因环境交互对结直肠癌发生、转移的影响。本研究将进一步加深对环境因素影响结直肠癌发生发展机制的认识，具有一定的理论意义。所识别的与结直肠癌发生、转移相关的遗传变异及基因环境交互作用可为结直肠癌高风险个体的筛查和肿瘤患者的预后监测提供科学依据。关键字结直

3、肠癌，生物钟，遗传变异，环境因素，交互作用项目组成员总数（含负责人）高级中级初级博士硕士学士5113203姓名性别出生年月学位职称项目分工工作单位研究领域郜艳晖女1973.9博士副高级协助设计及统计分析广东药学院遗传统计学叶新男1985.4学士初级及以下实验室检测及统计分析广东药学院肿瘤分子流行病学刘珺女1984.7学士初级及以下统计分析广东药学院流行病学王小丽女1986.10学士初级及以下实验室检测广东药学院肿瘤分子流行病学经费申请表 （金额单位：万元）预算科目省教育厅支持经费备注（计算依据与说明）一、科研业务费0.2000万元1、测试、计算、分析0.0000万元2、会议费、差旅费0.000

4、0万元3、出版物、文献、信息传播0.2000万元版面费(中文2000元/篇)4、其他0.0000万元二、试验材料费4.8000万元1、原材料、试剂、药品购置费4.8000万元探针引物4万元，化学试剂及耗材0.8万元2、其他0.0000万元三、仪器设备费0.0000万元1、购置0.0000万元2、试制0.0000万元四、劳务费0.0000万元五、其他费用0.0000万元1、万元2、万元3、万元4、万元合计5.0000与本项目有关的其他经费来源其他计划资助经费万元学校配套万元其他经费资助万元其他经费合计0.0000万元进度计划序号起止时间阶段性研究工作进展阶段性目标1 2012.1-2012.3实

5、验准备阶段：挑选SNP位点、定制SNP探针引物、购买试剂耗材、样本整理、预实验完成实验准备工作22012.4-2012.9实验阶段：SNP基因型检测完成实验室检测32012.10-2013.1资料整理与数据分析：SNP与结直肠癌发生、转移风险相关性分析；生物信息学分析。完成统计分析及生物信息分析42013.2-2013.6撰写论文及总结报告完成总结报告及论文预期成果论文（篇）总数2其中：CSCD核心期刊1三大索引收录1专著（部）0研究报告（篇）0专利（件）数量（件）申请0授权0其中发明专利申请0授权0鉴定成果（项）0软件登记（项）0新产品（种）（或新装备、新药等）0新技术（项）（或新工艺等）0

6、其他0申请书正文一、立项依据结直肠癌是严重威胁人类健康的常见恶性肿瘤之一，全球每年有超过100万例新发病例，并且有约60万例患者死于结直肠癌1。我国是传统的结直肠癌低发国，但近年来由于生活方式的“西方化”伴随着环境危险因素的暴露，结直肠癌的发病率呈现持续上升趋势。结直肠癌在我国城市和农村分别以每年31.95%和8.15%的速度递增，成为我国近十五年期间发病率上升速度最快的恶性肿瘤之一2。尽管结直肠癌的诊疗技术在近年有显著进展，但由于结直肠癌起病隐匿，约有60%的患者在初次诊断时已处于中晚期，结直肠癌总体死亡率高达50%3。结直肠癌已成为严重威胁我国居民生命健康的重大公共卫生问题，因此积极探索结

7、直肠癌的发病机制对于控制其流行、减轻其疾病负担具有重要的现实意义。国内外研究结果均证实了环境因素如高脂低纤维饮食、缺乏体力活动、肥胖等可以显著增加结直肠癌发病风险4。但关于环境因素如何促进结直肠癌发生发展的机制我们尚未清楚，阐明其中的机制对结直肠癌的防治工作将具有重大的实际意义。最近研究发现，某些环境因素比如夜间光照、高脂肪饮食、缺乏体力活动等可以通过影响生物的昼夜节律控制系统而促进癌症的发生5，综合目前的研究来看，控制生物昼夜节律的生物钟系统有可能作为中间桥梁参与了环境因素促进结直肠癌发生发展的过程6, 7，论述如下：生物昼夜节律(circadian rhythm)是人类在长期生物进化过程中

8、形成的，其发生的物质基础是生物钟系统。生物钟系统由一系列呈节律性表达的生物钟基因及其编码的蛋白质组成，构成一个或多个转录翻译反馈回路，以近于24小时的周期进行振荡8。在生物节律调节的核心环路中，钟基因编码蛋白CLOCK与BMAL1结合形成的CLOCK/BMAL1异二聚体通过与PER1、PER2、PER3，CRY1、CRY2等钟基因启动子部位的E-BOX结合，激活这些基因的转录，而生成的PER及CRY蛋白反馈性的抑制钟基因CLOCK与BMAL1的转录9。钟控基因(处于钟基因下游，受钟基因调节而表现为节律性表达的基因)含有可供CLOCK或BMAL1结合的E-BOX。CLOCK/BMAL1异二聚体也

9、可与钟控基因的E-BOX结合而促进钟控基因的转录，而钟基因PER1、PER2、PER3、CRY1、CRY2等则可通过抑制CLOCK或BMAL1转录进而间接抑制钟控基因的转录。在这个调节环路中，CLOCK 和BMAL1为钟基因的转录提供了最基本的动力，而PER2的负反馈调节则是其中最重要的负反馈机制9。生物钟系统虽然作为维持生命的基本系统保持高度的稳定性，但光照、激素水平、饮食、锻炼等因素可诱导外周组织中的生物钟重置10, 11。动物实验研究发现，高脂肪饮食会改变生物钟系统的外周生物钟的调控功能，进而扰乱体内的生物信号节律12, 13。同时有研究也发现规律的体育锻炼对于维持机体生物钟功能的稳定起

10、到了十分重要的作用14。这表明环境因素可通过调节生物钟的功能进而改变机体的生物钟节律。而多个研究已表明机体生物节律的改变通过多种途径增加肿瘤的发病风险。例如近年来针对昼夜节律变化与乳腺癌发病风险之间的研究就表明，夜班或轮班工作致使昼夜节律的混乱，导致乳腺癌的发病风险提高10%-60%，其分子机制可能为夜间照明的刺激，影响生物钟系统对褪黑素的分泌水平的昼夜调节，褪黑激素的夜间分泌减少导致雌激素分泌的增多，从而增加乳腺癌的患病风险15, 16。 近年来学者对生物钟基因在前列腺癌发病过程中的作用也进行了探讨，认为生物钟基因遗传变异通过对激素水平的调节来影响前列腺癌的发病风险17, 18。同时，研究还

11、发现许多调控细胞增殖的基因为钟控基因，比如原癌基因、抑癌基因等，生物钟通路的遗传变异可通过影响钟基因的表达或编码产物的功能进而干扰钟控基因的表达，直接或间接的参与多种肿瘤的发生、发展7, 15。而在结直肠癌的研究中则观察到，患者体内与结直肠癌发病风险密切相关的生长激素(Growth Hormone, GH)分泌的昼夜节律会发生改变，尤其是在肿瘤较大或已有肝转移、一般情况较差的肿瘤患者中，这种节律的改变表现得尤为明显19。这表明昼夜节律的改变可能会影响GH分泌的节律，进而增加结直肠癌发生的风险。更重要的是，最近的一项研究发现，结直肠癌组织中的生物钟通路关键基因BMAL1、PER2的表达异常与结直

12、肠癌发生、发展密切相关20。综合这些研究结果，我们提出研究假设：在结直肠癌的发病机制中可能存在着环境因素通过影响生物钟系统的功能从而促进结直肠癌发生发展的这一通路，并且生物节律调节环路上的关键基因CLOCK、BMAL1、PER2的遗传变异和环境因素一起共同影响结直肠癌的发病风险。为此，我们拟综合国内外最新的研究成果，围绕“结直肠癌相关生物钟通路关键基因遗传变异与环境因素交互作用的研究”这一中心议题，采用病例对照研究及单纯病例研究设计，应用标签SNP (tagSNP)策略，分析生物钟通路关键基因CLOCK、BMAL1、PER2遗传变异与结直肠癌发生、转移风险的相关性，并应用参数法与非参数法有机结

13、合的统计学策略重点探讨遗传变异之间及其与环境因素之间的交互作用对结直肠癌发生、转移的影响；并从生物信息学角度出发，对鉴定得到的与结直肠癌相关的遗传变异进行生物学机制的初步探讨。本研究成果将进一步加深对环境因素影响结直肠癌发生发展机制的认识，具有一定的理论意义。所识别的与结直肠癌发生、转移相关的遗传变异及基因基因、基因环境交互模型有可能应用于高风险个体的筛查和结直肠癌患者的预后监测。参考文献1. Ferlay J, Shin H-R, Bray F, et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008. In

14、ternational Journal of Cancer 2010; 127: 2893-2917.2. 中华人民共和国统计局. 2010中国卫生统计年鉴.3. American Cancer Society. Colorectal cancer facts and figures 2008-2010. Available at: http:/www.cancer.org/downloads/STT/F861708finalforweb.pdf.4. Khan N, Afaq F, Mukhtar H. Lifestyle as risk factor for cancer: Evidenc

15、e from human studies. Cancer Lett 2010; 293: 133-143.5. Gimble JM, Sutton GM, Ptitsyn AA et al. Circadian rhythms in adipose tissue: an update. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 2011 Oct7. Epub ahead of print6. Teboul M, Guillaumond F, Grechez-Cassiau A, Delaunay F. The nuclear hormone receptor family

16、round the clock. Mol Endocrinol 2008; 22: 2573-2582.7. Yu EA, Weaver DR. Disrupting the circadian clock: gene-specific effects on aging, cancer, and other phenotypes. Aging (Albany NY) 2011; 3: 479-493.8. Mazzoccoli G. The timing clockwork of life. J Biol Regul Homeost Agents 2011; 25: 137-143.9. Zh

17、ang L, Jones CR, Ptacek LJ, Fu YH. The genetics of the human circadian clock. Adv Genet 2011; 74: 231-247.10. Orozco-Solis R, Matos RJ, Lopes de Souza S, et al. Perinatal nutrient restriction induces long-lasting alterations in the circadian expression pattern of genes regulating food intake and ene

18、rgy metabolism. Int J Obes (Lond) 2011; 35: 990-1000.11. Sharma M, Majumdar PK. Occupational lifestyle diseases: An emerging issue. Indian J Occup Environ Med 2009; 13: 109-112.12. Kohsaka A, Laposky AD, Ramsey KM, et al. High-fat diet disrupts behavioral and molecular circadian rhythms in mice. Cel

19、l Metab 2007; 6: 414-421.13. Hoogerwerf WA, Hellmich HL, Cornelissen G, et al. Clock gene expression in the murine gastrointestinal tract: endogenous rhythmicity and effects of a feeding regimen. Gastroenterology 2007; 133: 1250-1260.14. Atkinson G, Edwards B, Reilly T, Waterhouse J. Exercise as a s

20、ynchroniser of human circadian rhythms: an update and discussion of the methodological problems. Eur J Appl Physiol 2007; 99: 331-341.15. Rana S, Mahmood S. Circadian rhythm and its role in malignancy. J Circadian Rhythms 2010; 8: 3.16. Sahar S, Sassone-Corsi P. Circadian clock and breast cancer: a

21、molecular link. Cell Cycle 2007; 6: 1329-1331.17. Cao Q, Gery S, Dashti A, et al. A role for the clock gene per1 in prostate cancer. Cancer Res 2009; 69: 7619-7625.18. Zhu Y, Stevens RG, Hoffman AE, et al. Testing the circadian gene hypothesis in prostate cancer: a population-based case-control stud

22、y. Cancer Res 2009; 69: 9315-9322.19. Sephton S SD. Circadian disruption in cancer: a neuroendocrine-immune pathway from stress to disease? Brain Behav Immun 2003; 17: 321-328.20. Oshima T, Takenoshita S, Akaike M, et al. Expression of circadian genes correlates with liver metastasis and outcomes in

23、 colorectal cancer. Oncol Rep 2011; 25: 1439-1446.二、研究方案1.研究目标、研究内容和拟解决的关键问题1.1研究目标(1) 探讨生物钟通路关键基因CLOCK、BMAL1、PER2遗传变异在中国人群结直肠癌发生、转移过程中的作用；(2) 阐明生物钟通路关键基因之间及基因与环境因素之间的交互作用对结直肠癌发生、转移的影响，以进一步揭示环境危险因素促进结直肠癌发生、发展的机制。1.2研究内容(1) CLOCK、BMAL1、PER2遗传变异与结直肠癌相关性的单位点分析：采用病例对照研究和单纯病例研究设计，应用标签SNP选择策略，运用TaqMan荧光定量

24、PCR技术检测生物钟通路关键基因CLOCK、BMAL1、PER2的标签SNP，采用2检验、logistic回归模型等方法分析各标签SNP基因型与结直肠癌发生、转移风险的统计学关联。(2) CLOCK、BMAL1、PER2遗传变异之间及其与环境因素之间的交互作用分析：采用参数法与非参数法有机结合的统计学策略，应用基于不同计算原理的统计方法包括多元logistic回归模型、多因子降维法、随机森林法等重点分析生物钟通路中基因基因、基因环境交互作用对结直肠癌发生、转移的影响。(3) 应用生物信息软件和数据库对与结直肠癌相关的遗传变异进行分子生物学机制上的初步分析：F-SNP (http:/compbi

25、o.cs.queensu.ca/F-SNP/)、SNP Function Annotation Portal (http:/brainarray.mbni.med.umich.edu/Brainarray/Database/SearchSNP/snpfunc.aspx)、FAST SNP (http:/fastsnp.ibms.sinica.edu.tw/pages/input_CandidateGeneSearch.jsp) 等综合性数据库整合了Ensembl、TFSearch、ESEfinder、SIFT、Polyphen 等在内的多个生物信息软件和数据库，可对遗传变异在转录、内含子剪接、

26、蛋白编码、翻译后修饰等水平的调控功能进行预测。我们拟利用这些综合性生物信息数据库对鉴定的结直肠癌阳性关联位点的功能进行初步分析，为后续的验证性功能学实验提供进一步的线索。1.3拟解决的关键问题系统阐明生物钟通路关键基因的遗传变异之间及其与环境因素之间的交互作用对结直肠癌发生和转移风险的影响；从生物信息学角度出发，初步探讨与结直肠癌发生和转移相关的遗传变异的生物学机制。 2.拟采取的研究方法、技术路线、试验方案和可行性分析2.1研究方法(1) 生物钟通路关键基因遗传变异与结直肠癌发生风险的关系：采用病例对照研究方法，应用logistic回归模型等方法评估生物钟通路关键基因的标签SNP基因型与结直

27、肠癌发生风险的统计学关联。考虑到多重假设检验可能导致结果假阳性过高的问题，应用错误发现率方法(False Discovery Rate, FDR)方法进行多重校正。应用传统logistic回归、多因子降维法、随机森林法等分析基因与基因、基因与环境因素的交互作用。(2) 生物钟通路关键基因遗传变异与结直肠癌转移风险的关系：采用单纯病例研究方法在上述的结直肠癌病例中分析生物钟通路关键基因遗传变异与结直肠癌转移程度的关联性分析，同样采用参数法结合非参数法的统计策略分析基因与基因、基因与环境之间交互在结直肠癌转移过程中的作用。(3) 应用F-SNP、SNP Function Annotation Po

28、rtal、FAST SNP等生物信息数据库对与结直肠癌发生、转移阳性关联SNP的功能进行初步的分析。2.2 技术路线及方案技术路线(1) 样本量估算及研究对象的选择：根据Power Program V3.0 (http:/www.mds.qmw.ac.uk/statgen/dcurtis/software.html) 的计算结果，对于低频等位基因频率(minor allele frequency, MAF)0.1的遗传变异，800对的样本量可以在=0.05的检验水平上提供至少90%的把握度检测出OR为1.5的统计学关联。 经过多年的合作和积累，项目申请者所属团队已经建立了较大规模的结直肠癌病例

29、和对照遗传资源和临床与人口学资料库。研究纳入的病例为经过组织病理学检验确诊的新发结直肠癌患者(含不同病理类型和临床分期)。病例分期依据全国结直肠癌协作组改良Duckes分期标准，A期为肿瘤局限于肠壁；B期为肿瘤已侵及肠壁外但无淋巴结转移；C期为肿瘤有淋巴结转移，无论肿瘤是否局限于肠壁；D期为肿瘤有远处转移及邻近器官侵袭无法无安全切除。研究排除同时罹患两种或以上的恶性肿瘤及有肿瘤既往史和由其他部位转移的肿瘤病例。研究纳入的对照为与病例同地区的体检正常个体，并在性别和年龄上与病例组匹配。本研究在研究对象自愿的情况下进行调查和采集血样，并签署知情同意书。(本部分工作已经完成)(2) 资料的采集： 采

30、用自制调查表，面询式调查各研究对象人口学及生活方式信息，包括性别、年龄、民族、受教育程度、结直肠癌家族史、疾病既往史、吸烟及饮酒等。结直肠癌病例的相关临床病理信息通过查阅病历获得，包括肿瘤部位、大小、分期及分化程度等。(本部分工作已经完成)(3) 标签SNP 选择及基因分型：利用人类基因组计划和国际单倍型计划HapMap (http:/hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的中国汉族居民(HCB)的基因型及连锁不平衡程度信息，采用HaploView V4.2软件，设定参数R20.8为标准挑选标签SNP，以覆盖目标基因CLOCK、BMAL1、PER2所有MAF0.1的SNP。我们采用TaqMan探针荧光定量PCR对所选定的标签SNP进行基因型检测。TaqMan荧光定量PCR技术成熟、结果可靠稳定、操作迅速，费用合理，完全可以满足我们对目标SNP基因型检测的需求，同时也可保证我们将基因分型成本控制在预算范围内。(4) 统计分析：