各类微生物生化实验方式原理.docx
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各类微生物生化实验方式原理
各类微生物生化实验方式原理
通常利用生化实验的方式，检测细菌对各类物质的代谢作用及其代谢产物，称为细菌的生化反映，经常使用于细菌的辨别。
一、糖类分解产物
（1）糖发酵实验（carbohydratefermentationtest）不同种类的细菌对糖的分解利用能力不同，一样以可否分解某种糖，是不是产酸产气等现象来辨别。
例如大肠杆菌能分解葡萄糖和乳糖，产酸且产气；而伤寒杆菌只分解葡萄糖产酸不产气，且不分解乳糖。
这是因为大肠杆菌分解葡萄糖等产生甲酸，经甲酸解氢酶的作用生成H2和CO2。
而伤寒杆菌无此酶，故分解葡萄糖只产酸不产气。
（2）VP实验（Voges-Proskauertest）产气杆菌将分解葡萄糖产生的两分子丙酮酸脱羧，生成一分子乙酰甲基甲醇。
乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中氧气氧化，生成二乙酰，二乙酰可与培育液中含胍基的化合物（如蛋白胨中的精氨酸）反映，生成红色的化合物，此为VP实验阳性。
大肠杆菌分解葡萄糖不生成乙酰甲基甲醇，故VP实验阴性。
（3）甲基红实验（methylredtest）大肠杆菌和产气杆菌均属G-短杆菌，且都能分解葡萄糖、乳糖产酸产气，二者不易区别。
但二者所产生的酸类和总酸量不一：
大肠杆菌可产生甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸等，而产气杆菌只产生甲酸、乙醇及乙酰甲基甲醇。
故大肠杆菌培育液PH在以下，加入甲基红指示剂呈红色，为甲基红实验阳性；产气杆菌培育液PH在以上，加入甲基红后呈桔黄色，为甲基红实验阴性。
（4）枸橼酸盐利用实验（citrateutilizationtest）产气杆菌在以枸橼酸盐为唯一碳源的培育基上生长，分解枸橼酸盐产生CO2，并转变成碳酸盐，使培育基由中性变成碱性，含溴麝香草酚蓝（BTB）指示剂的培育基由淡绿色变成深兰色，此为枸橼酸盐利用实验阳性。
大肠杆菌不能利用枸橼酸盐，故在此培育基上不能生长，培育基仍为绿色。
二、蛋白质及氨基酸的分解产物
（1）硫化氢实验（hydrogensulfidetest）有些细菌能分解培育基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、甲硫氨酸等）产生H2S，如遇醋酸铅或硫酸亚铁，能生成黑色的硫化物，为硫化氢实验阳性。
本实验经常使用于区别肠道杆菌的种类。
沙门氏菌属一样为阳性;大肠杆菌、产气杆菌、志贺氏菌为阴性。
（2）明胶液化实验（gelatinliguefactiontest）有些细菌具有明胶酶，能分解明胶使其失去凝固能力而液化。
变形杆菌、霍乱弧菌、绿脓杆菌、枯草杆菌等能液化明胶；大肠杆菌、沙门氏菌那么不能。
（3）吲哚实验（indoletest）有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成无色吲哚，加入对-二甲基氨基苯甲醛，无色吲哚生成红色玫瑰吲哚，
为吲哚实验阳性。
大肠杆菌、霍乱弧菌等吲哚实验阳性；产气杆菌、伤寒沙门氏菌为吲哚实验阴性。
吲哚对二甲基氨基苯甲醛玫瑰吲哚
细菌的生化反映是辨别细菌的重要手腕：
其中吲哚实验（I）、甲基红实验（M）、VP实验（V）和枸橼酸盐利用实验（C），简称为IMVIC实验，经常使用于大肠杆菌与产气杆菌的辨别。
典型的大肠杆菌的IMViC实验结果为“++--”，而产气杆菌是“--++”。
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实验四、微生物的快速鉴定和自动化分析技术
如何使微生物学技术方式快速、准确、简易和自动化，一直是微生物学工作者研究的热点，尤其是临床医学方面，对微生物的快速准确鉴定，更是"时刻确实是生命"。
近20连年来，随着微电子、运算机、分子生物学、物理、化学等先进技术向微生物学的渗透和多学科的交叉，这方面已取得了冲破性进展，许多快速、准确、灵敏、简易、自动化的方式技术，不仅在微生物鉴定中广为利用，而且在微生物学的其它方面也被采纳，推动了微生物学的迅速进展。
一、微量多项实验鉴定系统
该系统的全然原理是依照微生物生理生化特点鉴定的结果，而进行的数码分类鉴定。
这种技术也称为简易诊检技术，或数码分类鉴定法。
它是针对微生物的生理生化特点，配制各类培育基、反映底物、试剂等，别离微量（约）加入各个分隔室中（或用小圆纸片吸收），冷冻干燥脱水或不干燥脱水，各分隔室在同一塑料条或板上组成检测卡。
实验时加入待检测的某一种菌液，培育2~48小时，观看鉴定卡上各项反映，按判定表判定实验结果，用此结果编码，查检索表（依照数码分类鉴定的原理编制成），取得鉴定结果，或将编码输入运算机，用依照数码分类鉴定原理编制的软件鉴定，打印出结果。
微量多项实验鉴定系统已普遍用于动、植物检疫、临床查验、食物卫生、药品检查、环境监测、发酵操纵、生态研究等方面，尤其是临床查验中深受欢迎，迅猛进展。
国际上此技术的产品，或称系统，种类繁多，国内有河南开封医学生物研究所的肠杆菌科细菌鉴定卡E-15；上海市卫生防疫站的发酵性革兰氏阴性杆菌鉴定系统SWF-A；中国人民解放军一八一医院的厌氧菌快速生化鉴定系列ARB-ID；深圳华士达生物科技的肠杆菌科的细菌生化鉴定卡ENT等。
国外的产品已标准化、系统化和商品化，要紧有法国生物-梅里埃集团的API/ATB；瑞士罗氏公司的Micro-ID，Enterotube,Minitek；美国的Biolog全自动和手动细菌鉴定系统：
日本的微孔滤膜块等，其中API/ATB包括众多的鉴定系统，共计有750种反映，可鉴定几乎所有常见的细菌。
微量多项鉴测技术优势突出，不仅能快速、灵敏、准确、重复性好地鉴检微生物，而且简易，节省人力、物力、时刻和空间，缺点是各系统不同较大，有的价钱贵，有的个别反映不准，难判定，但毫无疑问，它是微生物技术方式向快速、简易和自动化进展的重要方向之一。
API20E系统是API/ATB中最先和最重要的产品，也是国际上应用最多的系统。
该系统的鉴定卡是一块有20个分隔室的塑料条，分隔室由相连通的小管和小环组成，各小管中含不同的脱水培育基、试剂，或底物等，每一分隔室可进行一种生化反映，个别的分隔室可进行两种反映，要紧用来鉴定肠杆菌科细菌，如图1所示。
图1API20E鉴定卡示用意
鉴定未知细菌的要紧进程：
将菌液加入每一个分隔室；培育后，有的分隔室的小杯中需要添加试剂，观看鉴定卡上20个分隔室中的反映变色情形，依照反映判定表（表1），判定各项反映是阳性仍是阴性反映；按鉴定卡上反映项目从左到右的顺序，每三个反映项目编为一组，共编为七组，每组中每一个反映项目定为一个数值，依次是一、二、4，各组中实验结果判定的反映是阳性者记"＋"，那么写下其所定的数值，反映阴性者记"－"，那么写为0，每组中的数值相加，即是该组的编码数，如此便形成了7位数字的编码，表2为举例说明；用7位数字的编码查API20E系统的检索表，或输入运算机检索，那么能将查验的细菌鉴定出是什么菌种或生物型。
表1 API20E反映判定表
鉴定卡上的反应项目
反应结果
代号
项目名称
阴性
阳性
ONPN
β-半乳糖苷酶
无色
黄
ADH
精氨酸水解
黄绿
红，橘红
LDC
赖氨酸脱羧
黄绿
红，橘红
ODC
鸟氨酸脱羧
黄绿
红，橘红
CIT
枸椽酸盐利用
黄绿
绿蓝
H2S
产H2S
无色
黑色沉淀
URE
尿素酶
黄
红紫
TDA
色胺酸脱氨酶
黄
红紫
IND
吲哚形成
黄绿
红
VP
.试验
无色
红
GEL
蛋白酶
黑粒
黑液
GLU
葡萄糖产酸
蓝
黄绿
MAN
甘露醇产酸
蓝
黄绿
INO
肌醇产酸
蓝
黄绿
SOR
山梨醇产酸
蓝
黄绿
RHA
鼠李糖产酸
蓝
黄绿
SAC
蔗糖产酸
蓝
黄绿
MEL
密二糖产酸
蓝
黄绿
AMY
淀粉产酸
蓝
黄绿
ARA
阿拉伯糖产酸
蓝
黄绿
表2API20E举例说明
项目名称
ONPG
ADH
LDC
ODC
CIT
H2S
URE
TDA
IND
VP
GEL
GLU
MAN
INO
SOR
RHA
SAC
MEL
AMY
ARA
所定数值
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
试验结果
+
-
+
+
+
-
-
-
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
记下数值
1
0
4
1
2
0
0
0
0
1
0
4
1
2
4
1
2
4
1
2
编 码
5
3
0
5
7
7
3
检索结果
5305773产气肠杆菌（Enterobacteraerogenes）
实验五、抗微生物药物灵敏性实验
一、实验目的
抗微生物药物灵敏性实验（药敏实验）的要紧目的检出细菌的耐药性，预测抗微生物药物的临床医治成效，并为临床医生针对某一特定的临床感染选用药物提供依据。
对所有临床分离的可疑致病菌，如不能从该菌的种属特点靠得住地推知其对抗菌药物的灵敏性，就需要进行药敏实验。
纸片扩散法
二、实验原理
此法是临床和实验室标准化研究所（CLSI/NCCLS）所推荐的临床微生物理学室常规开展的药敏实验方式。
将含有定量抗菌药物的纸片（药敏纸片）贴在已接种待检菌的琼脂平板表面特定部位。
药物借其分子的扩散力向周围琼脂中扩散，形成了随着离纸片距离加大，琼脂中的药物浓度慢慢减少的梯度浓度。
其纸片周围必然区域琼脂内的药物浓度高于抑制待检菌所需浓度时，那么该区域内细胞不能生长，形成透明抑制圈。
抑菌圈的大小能够反映待检对测定药物的灵敏程度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
三、实验器材和试剂
1．菌种 金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC2592二、铜绿假单胞菌ATCC27853或临床分离的菌株。
2．培育基 MH（Mueller-Hintion）琼脂。
3．试剂 无菌生理盐水，麦氏标准比浊管（McFarland
standard，相当于×108CFU/ml），抗菌药物纸片：
选用直径吸水量20μl的专用药敏纸片，包括阿米卡星（AMK）、青霉素（PEN）、氨苄西林（AMP）、哌拉西林（PIP）、头孢唑啉（FZN）、头孢呋辛（FRX）、头孢他啶（CAZ）、头孢他啶/棒酸（CD03）、氨曲南（ATM）、亚胺培南（IMP）、环丙沙星（CIP）、万古霉素（VAN）、克林霉素（CLI）、复方新诺明（SXT）。
4．其他 无菌棉拭子、镊子、毫米尺、接种环。
四、方式步骤
1．菌液制备
（1）对数生长法：
从琼脂平板上选取至少3-5个形态特点一致的菌落，用接种环转移至含4~5ml的肉汤培育管（如胰酶消化大豆肉汤）中，35℃孵育2-6h。
用无菌盐水或肉汤调整菌液浊度相当于麦氏标准。
（2）直接菌落法：
从孵育18-24h的非选择性培育基（如血琼脂）平板上，挑取单个菌落，直接用肉汤或无菌盐水制成麦氏标准浊度的悬液。
2．接种 细菌悬液制备后15min内接种至MH琼脂平板。
用无菌棉拭醮取菌悬液，在管内壁液面上方旋转紧压，将多余菌液挤去，最后沿平板内缘涂抹一周。
3．贴药敏纸片
涂布后的平板在室温下干燥3-5min，用纸片分派器或无菌镊子将纸片贴于琼脂表面并轻压，使纸片与琼脂表面完成接触。
各纸片中心相距应大于24mm，纸片贴上后就不能再移动位置。
4．孵育
将平板倒置放入35℃孵箱（苛养菌敏平板应放置于5%-10%CO2环境中），16-18h读取结果，葡萄球菌和肠球菌必需孵育24h以检测对苯唑西林和万古霉素的耐药性。
五、结果判定
抑菌圈的直径（包括纸片的直径），以毫米数报告（取整数）。
依照CLSI判定标准测量抑菌圈直径大小能够判定细菌对该抗生素是灵敏、中介仍是耐药。
灵敏（S）：
表示常规剂量的测定药物在体内所达到的浓度能抑制或杀灭待测菌。
中介（I）：
不是灵敏性的气宇，而是一个“缓冲区”，用以避免因微小的技术因素失控致使的结果误差，因此其临床意义是不确信的，故不该作临床报告。
耐药（R）：
表示常规剂量的测定药物在体内达到有效浓度时不能抑制待测菌生长。
六、药敏实验结果判定注意事项
（1）药敏实验的结果容易受培育基、抗菌药物、孵育条件等多种因素阻碍，实验室开展药敏实验时应按期用标准菌株对上述因素进行质量操纵。
（2）变形杆菌属的菌株可扩散到某些抗菌药物的抑菌圈内，因此在明显的抑菌圈内有薄膜样爬行生长能够忽略。
（3）关于链球菌应检测生长抑制圈而不是溶血抑制圈。
关于甲氧苄啶和磺胺，拮抗物可使细菌轻微生长，因此抑菌圈直径的检测不考虑细微生长的部份（生长菌苔的20%或以下）而测量比较明显的边缘。
（4）关于沙门菌属和志贺菌属的分离株只有氨苄西林、一种喹诺酮类药物和磺胺甲唑/甲氧苄啶可用于常规实验和报告，第一、第二代头孢菌素和氨基糖苷类抗生素体外可能对这些菌株有活性，但临床却无效，因此对上述药物不该报告为灵敏。
（5）沙门菌属的肠道外分离株应测试并报告氯霉素和一种三代头孢菌素的灵敏性。
（6）肠球菌属对头孢菌素类、氨基糖苷类（仅挑选高水平耐药性）、磺胺甲 唑/甲氧苄啶和克林霉素在体外可能有活性，但在临床上耐药，因此不能报告对这些药物灵敏。
七、阻碍药敏结果的因素
1.培育基：
应依如实验菌的营养需要进行配制。
倾注平板时，厚度适合（约5-6mm），不可太薄，一样90mm直径的培育皿，倾注培育基18-20ml为宜。
培育基内应尽可能幸免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性。
2.细菌接种量：
细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。
3.药物浓度：
药物的浓度和总量直接阻碍抑菌实验的结果，需精准配制。
商品药应严格依照其推荐医治量配制。
4.培育时刻：
一样培育温度和时刻为37℃8-18小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好抗菌药的平板培育基，先置4℃冰箱内2-4小时，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培育，能够推延细菌的生长，而取得较大的抑菌圈。
八、试探题
1.操作药敏实验并说出注意事项。
2.试述药敏实验的意义？
3.如何依照药敏实验的结果选择药物？
4.什么叫抑菌圈？
如何依照抑菌圈大小判定细菌对药物的灵敏度？
实验六、微生物的生理生化反映
微生物生理生化反映的多样性在自然界产生了两种结果:
第一是使自然界的有机分子都有可能取得分解;第二是使不同微生物之间有了相互作用和相互依托的基础.例如,一种微生物能利用另一种微生物所分解的产物,或一种微生物的产物可抑制或杀死另一种微生物.因此微生物的生理生化反映也被作为细菌鉴定和分类的内容。
一、大分子物质的水解实验
（一）目的要求
1.证明不同微生物对各类有机大分子的水解能力不同,从而说明不同微生物有着不同的酶系统。
2.把握进行微生物大分子水解实验的原理和方式。
（二）大体原理
微生物对大分子的淀粉,蛋白质和脂肪不能直接利用,必需靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用.胞外酶要紧为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内.如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精,双糖和单糖;脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸;蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等.这些进程都可通过观看细菌菌落周围的物质转变来证明:
淀粉遇碘液会产生蓝色,但细菌水解淀粉的区域,用碘测定再也不产生蓝色,说明细菌产生淀粉酶.脂肪水解后产生脂肪酸可改变培育基的pH,使pH降低,加入培育基的中性红指示剂会使培育基从淡红色变成深红色,说明胞外存在着脂肪酶。
微生物能够利用各类蛋白质和氨基酸作为氮源外,当缺乏糖类物质时,亦可用它们作为碳源和能源.明胶是由胶原蛋白经水解产生的蛋白质,在25℃以下可维持凝胶状态,以固体形式存在.而在25℃以上明胶就会液化.有些微生物可产生一种称作明胶酶的胞外酶,水解这种蛋白质,而使明胶液化,乃至在4℃仍能维持液化状态。
还有些微生物能水解牛奶中的蛋白质酪素,酪素的水解可用石蕊牛奶来检测.石蕊培育基由脱脂牛奶和石蕊组成,是昏浊的蓝色.酪素水解成氨基酸和肽后,培育基就会变得透明.石蕊牛奶也常被用来检测乳糖发酵,因为在酸存在下,石蕊会转变成粉红色,而过量的酸可引发牛奶的固化（凝乳形成）.氨基酸的分解会引发碱性反映,使石蕊变成紫色.另外,某些细菌能还原石蕊,使试管底部变成白色。
尿素是由大多数哺乳动物消化蛋白质后被分泌在尿中的废物.尿素酶能分解尿素释放出氨,这是一个分辨细菌很有效的诊断实验.尽管许多微生物都能够产生尿素酶,但它们利用尿素的速度比变形杆菌属（Proteus）的细菌要慢,因此尿素酶实验被用来从其他非发酵乳糖的肠道微生物中快速区分那个属的成员.尿素琼脂含有蛋白胨,葡萄糖,尿素和酚红.酚红在时为黄色,而在培育进程中,产生尿素酶的细菌将分解尿素产生氨,使培育基的pH升高,在pH升至时,指示剂就转变成深粉红色。
（三）器材
1.菌种枯草芽胞杆菌,大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）,一般变形杆菌。
2.培育基固体油脂培育基,固体淀粉培育基,明胶培育基试管,石蕊牛奶试管,尿素琼脂试管。
3.溶液或试剂革兰氏染色用卢戈氏碘液（Lugol'siodinesolution）。
4.仪器或其他用具无菌平板,无菌试管,接种环,接种针,试管架。
（四）操作步骤
l.淀粉水解实验
（1）将固体淀粉培育基溶化后冷却至50℃左右,无菌操作制成平板。
（2）用记号笔在平板底部划成四部份。
（3）将枯草芽孢杆菌,大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌别离在不同的部份划线接种,在平板的反面别离在四部份写上菌名。
（4）将平板倒置在37℃温箱中培育24h。
（5）观看各类细菌的生长情形,将平板打开盖子,滴入少量Lugol's碘液于平皿中,轻轻旋转平板,使碘液均匀铺满整个平板。
如菌苔周围显现无色透明圈,说明淀粉己被水解,为阳性.透明圈的大小可初步判定该菌水解淀粉能力的强弱,即产生胞外淀粉酶活力的高低。
2.油脂水解实验
（1）将溶化的固体油脂培育基冷却至50℃左右时,充分摇荡,使油脂均匀散布.无菌操作倒入平板,待凝。
（2）用记号笔在平板底部划成四部份,别离标上菌名。
（3）将上述四种菌别离用无菌操作划+字接种于平板的相对应部份的中心。
（4）将平板倒置,于37℃温箱中培育24h。
（5）掏出平板,观看菌苔颜色,如显现红色斑点说明脂肪水解,为阳性反映。
3.明胶水解实验
（1）取三支明胶培育基试管,用记号笔标明各管欲接种的菌名。
（2）用接种针别离穿刺接种（见图3—4B）枯草芽抱杆菌,大肠杆菌,金黄色葡萄球菌。
（3）将接种后的试管置20℃中,培育2～5d。
（4）观看明胶液化情形。
4.石蕊牛奶实验
（1）取两支石蕊牛奶培育基试管,用记号笔标明各管欲接种的菌名。
（2）别离接种一般变形杆菌和金黄色葡萄球菌。
（3）将接种后的试管置35℃中,培育24～48h。
（4）观看培育基颜色转变.石蕊在酸性条件下为粉红色,碱性条件下为紫色,而被还原时为白色。
5.尿素实验
（1）取两支尿素培育基斜面试管,用记号笔标明各管欲接种的菌名。
（2）别离接种一般变形杆菌和金黄色葡萄球菌。
（3）将接种后的试管置35℃中,培育24~48h。
（4）观看培育基颜色转变.尿素酶存在时为红色,无尿素酶时应为黄色。
（五）实验报告
1.结果
将结果填入下表,"+"表示阳性,"-"表示阴性
菌名
枯草芽孢杆菌
大肠杆菌
金黄色葡萄球菌
淀粉水解试验
脂肪水解试验
明胶液化试验
石蕊牛奶试验
尿素试验
2.试探题
（1）你如何说明淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？
（2）不利用碘液,你如何证明淀粉水解的存在？
（3）接种后的明胶试管能够在35℃培育,在培育后你必需做什么才能证明水解的存在？
（4）说明在石蕊牛奶中的石蕊什么缘故能起到氧化还原指示剂的作用？
（5）什么缘故尿素实验可用于鉴定Proteus细菌？
二、糖发酵实验
（一）目的要求
1.了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用
2.把握通过糖发酵辨别不同微生物的方式
（二）大体原理
糖发酵实验是经常使用的辨别微生物的生化反映,在肠道细菌的鉴定上尤其重要.绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源,可是它们在分解糖类物质的能力上有专门大的不同.有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳酸,醋酸,丙酸等）和气体（如氢气,甲烷,二氧化碳等）;有些细菌只产酸不产气.例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气;伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气,不能分解乳糖;一般变形杆菌分解葡萄糖产酸产气,不能分解乳糖.发酵培育基含有蛋白胨,指示剂（溴甲酚紫）,倒置的德汉氏小管和不同的糖类.当发酵产酸时,溴甲酚紫指示剂可由紫色变成黄色.气体的产生可由倒置的德汉氏试管中有无气泡来证明..
图.糖发酵实验
A.培育前的情形;B.培育后产酸不产气;C.培育后产酸产气
（三）器材
1.菌种大肠杆菌,一般变形杆菌斜面各一支。
2.培育基葡萄糖发酵培育基试管和乳糖发酵培育基试管各3支（内装有倒置的德汉氏小试管）。
3.仪器或其他用具试管架,接种环等。
（四）操作步骤
1.用记号笔在各试管外壁上别离标明发酵培育基名称和所接种的细菌菌名。
2.取葡萄糖发酵培育基试管3支,别离接入大肠杆菌,一般变形杆菌,第三支不接种,作为照.另取乳糖发酵培育基试管3支,一样别离接入大肠杆菌,一般变形杆菌,第三支不接种,作为对照。
在接种后,轻缓摇动试管,使其均匀,避免倒置的小管进入气泡。
3.将接种过和作为对照的6支试管均置37℃培育24~48h。
4.观看各试管颜色转变及德汉氏小管中有无气泡。
（五）实验报告
1.结果
将结果填入下表."+"表示产酸或产气,"-"表示不产酸或不产气
糖类发酵
大肠杆菌
普通变形杆菌
对照
葡萄糖发酵
乳糖发酵
2.试探题
假设某种微生物能够有氧代谢葡萄糖,发酵实验应该显现什么结果？
三、IMViC与硫化氢实验
（一）目的要求
了解IMViC与硫化氢反映的原理及其在肠道菌鉴定中的意义和方式
（二）大体原理
IMViC是吲哚（indoltest）,甲基红（methy1redtest）,伏一普（Voges-Prokauertest）和柠檬酸盐（citratetest）四个实验的缩写,I是在英文中为了发音方便而加上的.这四个实验主若是用来快速辨别大肠杆菌和产气肠杆菌（Enterobacteraerogenes）,多用于水的细菌学检查.大肠杆菌虽非致病菌,但在饮用水中假设超过必然数量,那么表示受粪便污染.产气肠杆菌也普遍存在于自然界中,因此检查水时要将二者分开，
硫化氢实验也是检查肠道杆菌的生化实验
吲哚实验是用来检测吲哚的产生.有些细菌能产生色氨酸酶,分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸.吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合,形成红色的玫瑰吲哚.但并非所有微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力,因此吲哚实验能够作为一个生物化学检测的指标。
大肠杆菌吲哚反映阳性,产气肠杆菌为阴性。
甲基红实验是用来检测由葡萄糖产生的有机酸,如甲酸,乙酸,乳酸等.当细菌代谢糖产生酸时,培育基就会变酸,使加入培育基的甲基红指示剂由橘黄色变成红色,即甲
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