WESTERNBLOT试验方法和步骤.docx
《WESTERNBLOT试验方法和步骤.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《WESTERNBLOT试验方法和步骤.docx(8页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
WESTERNBLOT试验方法和步骤
.WESTERNBLOT试验方法和步骤
试剂配方
裂解液A
试剂浓度1000mlDDW含量Tris-Cl(pH7.5)50mM6.057g
EDTA2mM0.744g
NaCl150mM8.766g
裂解液B
试剂浓度1000mlDDW含量Tris-Cl(pH7.5)50mM6.057g
glycerol(甘油)10%v/v100ml
magnesiumacetate(醋酸镁)5mM1.07g
EDTA0.2mM0.0744g
抑制剂(临用前加)
抑制剂原液浓度A或B中的终浓度A和B中加入体积(ul/ml)
Leupeptin1mg/ml10μg/ml10μl
Pepstatin1mg/ml10μg/ml10μl
Aprotinin1mg/ml1μg/ml1μl
DTT0.1M(15.4mg/ml)0.5mM5μl
NaF10M(0.42g/ml)100mM10μl
钒酸钠0.2M(0.08g/ml)2.0mM10μl
PMSF(巨毒)0.1M(17.4mg/ml异丙醇)1.0mM10μl
NaN35%0.02%4μl
应添加苯甲脒1mM暂未加
分离胶缓冲液:
1.5MTris-HCl(pH8.8)
Tris18.17g
DDW80ml
用HCl调pH至8.8后加水定容100ml
浓缩胶缓冲液:
0.5MTris-HCl(pH6.8)
Tris3.03g
DDW30ml
用HCl调pH至6.8后加水定容50ml
5×电泳缓冲液(分子克隆影印版A1.17)
Tris7.57g
甘氨酸46.92g
SDS2.5g
DDW500ml
5×转膜缓冲液(分子克隆影印版A8.52)
Tris14.52g
甘氨酸7.32g
SDS0.94g(可不加)
DDW400ml
临用前取80ml,加DDW320ml,甲醇100ml,混匀即可。
2×Loadingbuffer(SDS-PAGE加样缓冲液):
(分子克隆影印版A1.20)
0.5MTris-HCl(pH6.8)2ml
10%SDS4ml
甘油2ml
二巯基乙醇156μl
1%溴酚蓝2ml
-20℃避光保存
考马斯亮蓝染液
考马斯亮蓝R-2501.25g
甲醇250ml
冰乙酸50ml
蒸馏水200ml
脱色液Ⅰ
甲醇200ml
冰乙酸50ml
蒸馏水200ml
脱色液Ⅱ
甲醇50ml
冰乙酸75ml
蒸馏水875ml
丽春红染液:
丽春红1g
乙酸2ml
DDW200ml
0.2MTBSpH7.4
Tris-base4.85g
DDW150ml
1NHCl约4ml调pH值至7.4后定容于200ml临用前稀释十倍
一、匀浆
1、配裂解液A和B.
2、取适量A、B液,加入酶抑制剂.
3、取所需组织块于溶液A中,浸泡五分钟,用剪刀剪成碎块.
4、将组织块转移入二倍体积的溶液B中,电动匀浆9,000转3分钟,浸泡30-60分钟.
5、超声震荡三分钟,
6、低温离心9,000r/分,15分钟.
7、取上清液-20℃保存,待用。
注:
以上所有操作均需在冰上进行。
二、电泳
1、制胶:
(1)分离胶:
组装灌胶模具及电泳槽配分离胶,加入各溶液后振摇,使其充分混匀。
小心用吸管将凝胶加入灌胶模具内,至距梳齿下缘约1-1.5cm,并避免产生气泡,然后在分离胶上面加入一层约5mm厚的水层以隔绝与空气的接触,直立置于室温下20-60min,直至凝胶聚合。
在凝胶聚合后,会在分离胶和水层之间出现一个清晰的折光线。
分离胶终浓度:
10%总体积:
6ml
30%acr/bis2ml
分离胶缓冲液(pH8.8)1.6ml
10%SDS60μl
DDW2.32ml
10%过硫酸铵20μl(冬天40μl)
TEMED4μl
(2)浓缩胶:
吸尽分离胶上的水,将梳子置于分离胶上,配浓缩胶。
同样加入各溶液后振摇,使其充分混匀。
小心用吸管将凝胶将浓缩胶缓慢加入分离胶表面,注意不能产生气泡;室温下静置1小时以上,使凝胶充分聚合。
浓缩胶总体积:
1.875ml
30%acr/bis250μl
浓缩胶缓冲液(pH6.8)475μl
10%SDS18.75μl
DDW1.138ml
10%过硫酸铵8μl(冬天16μl)
TEMED2μl
(3)小心拔除梳子,不要将加样孔撕裂。
(4)也可选择梯度胶,即:
分离胶由下到上分为12%和10%二层。
终浓度:
12%总体积:
2ml
30%acr/bis1.2ml
分离胶缓冲液(pH8.8)0.8ml
10%SDS30μl
DDW960μl
10%过硫酸铵15μl(冬天30μl)
TEMED1.6μl
2、上样:
取上述匀浆样品,加入同体积的2×Loadingbuffer,上样于加样孔中。
恒压:
浓缩胶80V,分离胶100V,电泳至溴酚蓝到分离胶底部。
3、染色:
取其中所需条带,考马斯亮兰染色过夜.脱色夜Ⅰ、Ⅱ各脱色1-2个小时,观察电泳条带.
注:
过硫酸铵量应随着温度下降而增加。
凝胶从玻板上分离后,就立刻固定于转膜缓冲液中。
Gelneedtobefixintransferbuffersoonjustafteritiscutfromglas
三、转膜withoutSDS
1、取需转膜的胶带,按胶的大小,裁所需的六层滤纸和NC膜。
将滤纸和膜垂直放于转膜缓冲液中,以虹吸作用使其湿润(以减少气泡)后,从负极到正极依次按照海绵→三层滤纸→胶→硝酸纤维素膜(NC膜)→三层滤纸→海绵的顺序放置,300V,276mA转35-50分钟(一般转45min,温度降低转膜时间延长,主要看marker是否转上。
)
注:
除尽各层间的气泡。
2、观察Marker的颜色,若所需蛋白质条带附近的Marker已转到膜上,则停止转膜,否则延长时间。
一般大分子量蛋白质所需时间较长,小分子量(80KD)以下,可缩短转膜时间。
3、丽春红染色十分钟后蒸馏水洗膜,观察蛋白质条带。
注:
转膜和电泳缓冲液最多只能用三次。
四、印迹
1、封闭:
(1)将结合有蛋白质的NC膜放入牛奶中,封30min。
封闭液:
Milk(5%)1.5g
0.02MTBS30ml
Tween20(0.5%)150μl
(2)4%BSA封闭五分钟。
注:
预试验背景较强时可适当延长封闭时间。
3、加一抗
将NC膜放入塑料袋中,加入用抗体稀释液稀释好的一抗,热封口器封口,4℃过夜或者37℃孵育2小时。
4、洗膜10分钟×3次
洗液:
0.02MTBS100ml
Tween20500μl
5、二抗
将NC膜放入塑料袋中,加入辣根过氧化物酶标记的二抗(洗液稀释,抗体稀释度预先确定),用热封口器封口,37℃孵育1小时。
此步也可分了二步,即:
先加入无酶标的二抗,37℃孵育1小时,洗膜后,再加入酶标的二抗和SABC。
注:
稀释液中不能NaN3
6、DAB显色含洗膜10分钟×3次,后加入DAB显色。
DAB:
1mlDDW中加入TBS、H2O2、DAB各50μl。
注:
一抗推荐稀释度:
1:
500→1:
2000;二抗:
1:
2500
7、ECL显色
二溶液等体积混匀(各500μl),滴于NC膜上,并不停吹洗,3-5分钟后吸干膜边缘的水分,将NC膜包于塑料薄膜中,放入暗盒盖上胶片,分别曝光1秒、3秒、5秒、1分钟、5分钟、8分钟后,洗片。
曝光时间可根据前面所冲胶片的背景决定,背景强则减少曝光时间,否则延长曝光时间。
0.125ml/pcm3,Roomtemperature,notextensivelight,for5minutes,
absorbtheWorkingsolution.FaceuptoX-rayfilm.
附:
常规蛋白质的近似分子量
δ-catenin:
133kD
KA2:
123kD
spinohilin:
120kD
KA1:
114kD
GluR2:
110kD
GluR1:
106kD
stat3:
90kD
synapsinⅠ:
80kD
NF-κB:
65kD
β-actin:
42kD
c-jun:
39KD
Caspase:
32kD
Bcl2:
26kD
Bax:
23kD
GAS748kD
Tubulin55kD
AKT260kD
PKA(全酶)150-170kD
PKA(催化亚基)50kD(sc-904)
CREB(rat)36kD(博士德)