预防兽医学专业微生物与免疫学方向毕业论文.docx
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预防兽医学专业微生物与免疫学方向毕业论文
毕业设计（论文）
禽波氏杆菌ompA-IgYFc融合蛋白表达及松花粉多糖对鸡体免疫应答的调节作用
学院名称
学院名称
专业名称
专业名称
学生学号
学生学号
学生姓名
学生姓名
指导教师
教授姓名
助理指导老师
老师姓名
202年月
符号说明
英文缩写
英文全称
中文名称
B.avium
bordetella
禽波氏杆菌
bp
basepair
碱基对
BSA
bovineserumalbumin
牛血清蛋白
ConA
concanavalinA
刀豆素球蛋白A
CPE
cytopathiceffect
细胞病变
d
day
天
dpi
daypostinfection
感染后天数
DMSO
dimethylsulfoxide
二甲基亚砜
DNA
deoxyribonucleicacid
脱氧核糖核酸
EDTA
Ethylenedianinetetra-acetic
乙二胺四乙酸
ELISA
Enzymelinkedimmunosorbentassay
酶联免疫吸附试验
FBS
fetalbovineserum
胎牛血清
FDA
foodanddrugadministration
美国食品药品监督管理局
FITC
fluoresceinisothiocyanate
异硫氰酸荧光素
g
gram
克
h
hour
小时
IgG
immunoglobulinG
免疫球蛋白G
IgY
immunoglobulinY
免疫球蛋白Y
IFA
Indirectimmunofluorescence
间接免疫荧光
IL-2
Interleukin-2
白介素2
IL-4
Interleukin-4
白介素4
kb
kilobase
千碱基（对）
L
liter
升
LD50
medianlethaldose
半数致死量
LTR
Lymphocytetransformationrate
淋巴细胞转化率
mg
microgram
微克
MHC-II
majorhistocompatibilitycomplex
主要组织相容性复合体二类分子
min
minute
分
mL
milliliter
毫升
MTT
MTTThiazolylblue
噻唑蓝
OD
Opticaldensity
光密度值
PBS
PhosphateBufferedSaline
磷酸盐缓冲液
PCR
Polymerasechainreaction
聚合酶链式反应
P.pastoris
Pichiapastoris
毕赤酵母
PTH
ParathyroidHormone
甲状旁腺激素
RNA
ribonucleicacid
核糖核酸
rpm
rotationperminute
每分钟转速
s
second
秒
SDS-PAGE
Sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis
十二磺酸钠-聚丙烯酰胺
凝胶电泳
SPF
Specificpathogenfree
无特定病原体
Tc
cytotoxicTcell
细胞毒性T细胞
Th
helperTcell
辅助性T细胞
TNF-α
tumornecrosisfactor
肿瘤坏死因子
TPPPS
TaishanPinusmassonianapollenpolysaccharide
泰山松花粉多糖
中文摘要
目前对于一些传染性疾病，灭活苗和活苗已被广泛应用，然而由于疫苗的灭活制备过程，使其抗原的物理及化学结构发生改变，从而影响了疫苗对机体的免疫保护能力。
随后，人们生产出的具有天然结构和统一快速生产特性的重组亚单位疫苗也被广泛用于预防各种传染性疾病，然而，由于重组亚单位疫苗在机体的快速清除等影响，使得蛋白质或多肽通常具有较短的血清半衰期及有限的抗原刺激。
因此为了更有效的控制禽类传染病，亟需开辟新的途径，研发新型疫苗。
近年来，将哺乳动物免疫球蛋白Fc与外源蛋白连接的融合技术已经被开发出来，这种技术中IgGFc片段的连接赋予了融合的外源蛋白质或多肽类似抗体的特性，不仅增强了对抗原捕获的速度和效率，同时还增强了融合蛋白的血清半衰期。
然而对于融合表达的IgYFc是否与融合表达的IgGFc一样，可以有效促进动物机体的非特异性免疫应答和特异性免疫应答，目前还没有被研究。
因次，在本项研究中，实验室以一种常见的可导致禽类呼吸道疾病的禽波氏杆菌（Borderellaavium）中具有免疫原性的外膜蛋白A（ompA）为模型，使用巴斯德毕赤酵母GS115真核表达系统，表达连接有鸡IgYFc和禽波氏杆菌ompA的融合蛋白；首先检测ompA-Fc融合蛋白对鸡腹腔巨噬细胞活性的影响，以评价连接的Fc对鸡体非特异性免疫应答的影响；再将融合蛋白免疫雏鸡，以评价连接的Fc对特异性免疫应答的影响；此外，本实验室经多年研究发现，泰山松花粉多糖（Taishanpinusmassonianapollenpolysaccharide,TPPPS）作为一些灭活疫苗及亚单位疫苗的佐剂时表现出良好的免疫增强效果，因此，TPPPS作为一种免疫调节剂对巨噬细胞的活化，以及用作佐剂对融合蛋白的免疫增强效果也被探究。
本研究分以下三部分内容：
1.ompA-Fc融合蛋白毕赤酵母转化子的构建，表达及产物分析
对GenBank中公布的禽波氏杆菌ompA及鸡IgYFc基因序列分别设计特异性引物，以本实验室先前分离得到的禽波氏杆菌DNA及本试验提取的鸡脾脏RNA为模板，采用SOE-PCR的方法进行重组基因的扩增。
随后对扩增后的重组基因连接转化至pMD18-T
克隆载体，同时基因测序鉴定重组克隆载体中重组基因序列，随后利用限制性内切酶XhoI和NotI对测序成功的重组克隆载体进行双酶切及产物胶回收，随后将回收产物与经相同酶酶切后的表达载体pPIC9再次进行连接转化。
之后，将基因测序验证正确的重组表达质粒线性化，并转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，对经RDB板筛选的阳性转化子进行PCR鉴定及基因测序。
与此同时，以转化的空质粒pPIC9载体做为阴性对照。
对经PCR检测正确的毕赤酵母阳性转化子及空质粒对照分别进行甲醇诱导表达。
表达后的产物通过SDS-PAGE检测分析，与蛋白凝胶层中阴性对照孔相比，在阳性孔中显示有一条与目的蛋白分子量大小一致的约为47.4kDa的条带。
毕赤酵母表达的融合蛋白在72h获得最大蛋白质产量（18mg/L）。
随后对表达的蛋白经镍柱进行纯化，并且SDS-PAGE检测分析中同样检测到一条大小约为47.4kDa蛋白条带。
分别用抗His标签抗体，大鼠抗omp多克隆抗体和兔抗鸡IgG（HRP）进行Westernblot分析以确定表达后融合蛋白的免疫原性。
在这三次独立DAB显色测定后，均观察到一条大小约47.4kDa的目的条带；经对照确定该条带与之前在SDS-PAGE检测的条带分子量大小一致。
结果表明，表达的融合蛋白中IgYFc和ompA保持其各自独立的免疫原性。
此外，本试验通过SWISS-MODEL软件利用同源建模方法预测融合后ompA-Fc蛋白的三维空间结构，发现融合蛋白中两个蛋白在柔性肽的连接下分别进行各自空间结构的折叠相互不影响。
此外，本实验室先前构建的pPIC9-ompA表达质粒用作本研究中的阴性对照，此表达质粒表达的ompA蛋白的免疫原性也进行了验证。
2.ompA-Fc融合蛋白与TPPPS对巨噬细胞活力影响试验
体外培养鸡腹腔巨噬细胞，MTT法测定不同浓度的融合蛋白ompA-Fc、ompA及TPPPS对巨噬细胞的细胞毒性，以确定后续试验最佳使用剂量。
之后分别将特定浓度的ompA-Fc-TPPPS、ompA-Fc、ompA和PBS与腹腔巨噬细胞共培养，中性红试验检测腹腔巨噬细胞胞饮活性，Griess法、ELISA试剂盒分别检测腹腔巨噬细胞NO及TNF-α分泌能力，间接免疫荧光法检测腹腔巨噬细胞对ompA吞噬能力，流式细胞仪检测腹腔巨噬细胞分泌MHC-II分子的能力。
结果表明，ompA-Fc、ompA蛋白及TPPPS对腹腔巨噬细胞细胞毒性不明显，并且TPPPS可剂量依赖性的增加细胞数量。
同时，TPPPS也剂量依赖性的提高腹腔巨噬细胞胞饮、NO、TNF-α分泌能力。
此外，连接的Fc及TPPPS佐剂也显著提高了腹腔巨噬细胞对ompA吞噬活性及MHC-II分子的表达。
以上研究表明，连接IgYFc的融合蛋白可有效提高腹腔巨噬细胞的活性，而TPPPS为一种有效巨噬细胞激活剂。
3.TPPPS对融合蛋白的免疫增强效果的研究
将本实验室经水提醇沉法提取的泰山松花粉多糖与经毕赤酵母表达系统提取的融合蛋白ompA-Fc、ompA等体积混合配比制备相应疫苗，-80°C备用。
随后对120只SPF雏鸡随机分成4组，之后分别在3、7、14d后，对各组雏鸡进行颈部皮下接种0.2mLompA-Fc-TPPPS、ompA-Fc、ompA亚单位疫苗和PBS。
随后在首免后的第7、14、21、28、35、42、49d，对各实验组随机抽取3只鸡进行心脏采血收集样品，以检测其血清抗体效价，白细胞介素-2、白细胞介素-4（IL-2、IL-4），外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞含量及T淋巴细胞转化率。
同时在三免后的1周后，对各组随机抽取的20只鸡攻毒，进行动物保护试验测定（除对照组），期间连续7d对各组鸡群临床症状及保护率进行观察并记录。
试验结果表明，单纯的ompA-Fc亚单位疫苗可有效诱导机体产生抗ompA特异性抗体，分泌IL-2、IL-4，提高CD4+T、CD8+淋巴细胞百分含量和T淋巴细胞转化率，同时提供了近80%的动物保护率。
值得注意的是，TPPPS作为佐剂，能显著提高机体细胞及体液免疫反应。
研究表明，连接的Fc与TPPPS组合协同促进由抗原诱导的全身性免疫应答。
总体而言，本试验的研究结果对预防家禽疾病的亚单位疫苗的研制提供了一个新的思路和方法。
关键词：
IgYFc；毕赤酵母表达；亚单位疫苗；泰山松花粉多糖；腹腔巨噬细胞
Abstract
Inactivatedorkilledvaccineshavebeenwidelyappliedtocontrolinfectiousdiseases.However,conventionalformalin-orheat-inactivatedvaccineformulationscanalterthephysio-chemical/structuralpropertiesoftheantigens,therebynegativelyaffectingthedevelopmentofprotectiveimmunity.Recombinantsubunitvaccinescanbeusedtoeffectivelypreventbacterialdiseasesbecauseoftheirresemblancetothenativeformaswellastheirrapid,consistent,andscalableproduction.Proteinsorpeptidesgenerallyshowshortserumhalf-lifeandlimitedantigenicstimulationbecauseofconventionalantigencapturebyantigenpresentingcells（APC）andthefastrenalclearance.Therefore,itisimportanttodevelopanovelvaccinetopreventinfectiousdiseases.Currently,Fc-fusiontechnologies,inwhichimmunoglobulinFcisgeneticallyfusedtoanantigenicprotein,havebeendevelopedtoconferantibody-likepropertiestoproteinsandpeptides.MammalianIgG–Fcfusionexhibitsimprovedantigen-inducedimmuneresponsesbyprovidingaggregateswithhighavidityfortheIgGFcreceptor（FcR）andsalvagingtheantigenicportionfromendosomaldegradation.However,whetherthelinkedchickenIgYFcfragmentsharessimilarcharacteristicstomammalianIgGFcremainsunclear.
Inthisstudy,weestablishedthelinkedchickenIgYFcmodel,andusedP.pastorisGS115eukaryoticexpressionsystemtoexpressafusionproteincontainingthechickenIgYFcandompAofBordetellaavium,acommonrespiratorydiseasepathogenofavianspecies.Firstly,theeffectofompA-FcfusionproteinontheactivityofchickenperitonealmacrophageswasevaluatedtoevaluatetheeffectofthelinkedFconthenon-specificimmuneresponseofchickens.Then,thefusionproteinwasusedtoimmunizechickenstoevaluatetheeffectofFconspecificimmuneresponses.Inaddition,inourpreviousstudies,wefoundthatTaishanPinusmassonianapollenpolysaccharides（TPPPS）isaneffectiveadjuvantfortheinactivatedandsubunitvaccines.TPPPSwasalsousedasimmuneadjuvanttoinvestigateitsirritationonchickenperitonealmacrophagesandimmunomodulationonompA–Fc-inducedimmunoresponses.Thisstudywasdividedintothefollowingthreeparts:
1.ExpressionandidentificationofthefusedompA-Fc
ThechickenIgYFcandB.aviumompAgeneswerelinkedbyoverlappingPCRtechnology.ThelinkedompA–FcgenefragmentwasclonedintotheexpressionvectorpPIC9andverifiedbygenesequencing.TherecombinantpPIC9-ompA–FcplasmidwasthentransformedintoP.pastoris.Uponinductionwithmethanolatdifferentinductiontimes,anovelproteinbandcorrespondingto47.4kDaintheculturesupernatantoftherecombinantpPIC9-ompA–FctransformantwasdeterminedthroughSDS-PAGE;however,thisbanddidnotappearintheculturesupernatantofthecontrolpPIC9（blankplasmid）transformant.Theproteinwasdetectedinthesupernatantafter48hofcultivation,andthemaximumproteinyield（18mg/L）wasobtainedat72h.Afterpurification,onlythetargetproteinbandwithamolecularweightof47.4kDawasobservedintheresultsofSDS-PAGE.
Westernblotanalyseswereperformedwithanti-Histagantibody,ratanti-omppolyclonalantibody,orrabbitanti-chickenIgG（HRP）todeterminetheimmunogenicityofthefusionprotein.Aftercolordevelopment,a47.4kDabandwasobservedinthethreeindependentassays;thisbandcorrespondedtothebanddetectedintheSDS-PAGE.TheresultsindicatedtheindependentimmunogenicityofthefusedIgYFcandompAofB.avium.Moreover,atthestartofompA–Fcfusion,antigensexpressedinP.pastoriswerepresentedinaschematicand3DstructureofthefusionproteinompA–FcanddevelopedthroughhomologymodelingmethodsofSWISS-MODEL.Inaddition,therecombinantpPIC9-ompAplasmidconstructedinourlaboratorywasusedascontrolinthepresentstudy;theimmunogenicityoftherecombinantompAexpressedinP.pastoriswasalsoverified
2.InfluencesofthelinkedFcandTPPPSontheviabilityofperitonealmacrophages
Chickenperitonealmacrophageswereisolatedwithpreviousmethod.TheviabilityofmacrophagestreatedwiththerecombinantompAandompA–FcwereassayedbyMTTtoassesstheeffectsoftherecombinantproteinsonthegrowthofchickenperitonealmacrophages.ThecytotoxicityofTPPPS,whichwasusedastheadjuvantinthefollowingexperiments,wasexamined.Internalizationintheformofpinocytosisorphagocytosisisakeyindicatorofmacrophageeffectoractivity.NOandTNF-αsecretedbymacrophagesalsoreflecttheactivityofthecells.TheeffectofTPPPSonthepinocyticactivityofperitonealmacrophageswasassayedvianeutralreduptake.Immunofluorescentassay（IFA）wasperformedtoanalyzeompAphagocytosis.TheexpressionofmajorhistocompatibilitycomplexclassII（MHC-II）moleculesonthesurfaceofmacrophageswasdetectedbyflowcytometryanalysis.Theresultsindicatedthattreatmentwithrecombinantproteinsdidnotchangetheviabilityofchickenperitonealmacrophages,whereasTPPPSdose-dependentlypromotedtheproliferationandviabilityofperitonealmacrophages.Similarly,linkedFcandTPPPSadjuvantremarkablyincreasedtheantigencapturecapacityofchickenperitonealmacrophages.TheadditionofTPPPSfurtherenhancedMHC-IIexpressiononfusedompA–Fc-treatedmacrophages.ThesedataimplythatthelinkedFcandTPPPSadjuvantwerelikelyalsofacilitatetotheantigenproc
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