药理实验方法学重点.docx

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药理实验方法学重点

一．1.首过效应：

口服给药后，药物在到达体循环之前，经肠道、肠壁和肝脏的代谢分解使进入生物体内的相对药量降低。

2，判断方法：

尾静脉给药AUC和门静脉给药AUC—比较判断肝首过—是—尾静脉》门静脉;门静脉给药和十二指肠给药AUC—比较判断肠首过—是—门静脉》十二指肠十二指肠和灌胃给药AUC—比较判断胃首过—是—十二指肠AUC》灌胃AUC二．简述肾外包扎性高血压模型制备的基本原理和注意事项?

答：

原理：

肾外异物包扎，可致肾周围炎，肾外形成一层纤维性鞘膜，压迫肾实质，造成肾组织缺血，使肾素形成增加，进而使血管紧张素含量增加，血压上升。

属肾性高血压模型。

注意事项：

1）肾外包扎材料除自制双层孔胶薄膜和玻璃纸外，还可用绸布、乳胶、火棉胶等材料。

肾外包扎应足够紧，但不能勒破组织。

2）如果要制造2肾1扎型，则一侧肾包扎后无需切除另一侧肾，术后3~6个月10%~20%动物形成高血压；如果要制造2肾2扎型，则一侧肾包扎后同法包扎另一侧肾，术后3~4周70%以上动物形成高血压。

三、

（一）佐剂性关节炎1.大鼠AA的制备：

选用雄性Lewis、Wistar或SD大鼠，体重200g左右，将每鼠右后足趾皮内注射完全弗氏佐剂（CFA）0.1ml致炎。

CFA是将卡介苗或死结合分枝杆菌加入已经高压灭菌的液体石蜡中，浓度为10mg/ml。

原发病变主要表现为早起致炎局部的炎症反应，致炎后18h右后足的肿胀达峰值，持续3d后逐渐减轻，8d后再度肿胀；继发病变一般出现于致炎后10d左右，表现为对侧和前肢的肿胀，耳和尾部出现“关节炎”小结，变应性角膜翳以及体重下降等等。

2.小鼠AA的制备：

选用雄性C57BL/6小鼠，8周龄，4%氟烷吸入麻醉，左侧胫-跗关节皮下两点皮下注射100ulCFA，CFA浓度为5ug/ul，对照组同方法注射液状石蜡。

造模后22d处死。

造模24h内原发侧关节出现急性肿胀，第9天肿胀较严重。

模型组穿格子数和活动度明显降低。

造模后小鼠对于机械异常性疼痛和热痛出现明显退缩反应。

（二）II型胶原诱导的关节炎1.小鼠CIA的制备：

将鸡或牛II型胶原（CII）溶解于0.01mol/L的醋酸后与同等容积的含有低浓度卡介苗的液体石蜡油（ALCB）充分乳化，CII和ALCB的计量均为4mg/mL.,乳化在冰浴中进行。

在小鼠（18g左右）根部多点皮内注射乳化剂0.1ml，第21d在尾根部加强注射。

加强注射后，由第三者检查关节炎的发生情况。

2.大鼠CIA的制备：

CII溶解于0.01mol/L的醋酸中（CII终浓度为4mg/ml），充分研磨，4度过夜，讲CII溶液滴加至冷的不完全弗氏佐剂（IFA）中，等体积混合，充分乳化。

大鼠（体重150g左右）尾根部和背部分多点皮内注射0.1mLCII乳化剂。

7d后同法再坚强注射一次。

对照组注射0.01mol/L醋酸和IFA的乳化液。

从第20d后开始，用组织测量仪测定后足趾的容积。

评价指标：

足趾肿胀度、全身表现评分、关节肿胀数、关节炎指数、X线评分、关节炎病理评分。

四、祛痰药的药理试验方法1）.呼吸道分泌液量测定法小鼠酚红实验法,基本原理：

利用酚红小鼠腹腔注射后部分从气道排泄的特点，测定小鼠气道酚红排泄量，以判断受试药对气道通透性和分泌液量的影响.操作步骤：

小鼠饥饿16-18h--注射酚红前30min受试药物灌胃--腹腔注射酚红药

物，30min后处死--血凝后，分离气管、气管插管并与注射器相连--用5%NaHco30.8ml洗气管，反复三次--合并洗液，放置，得透明红色上清液，用分光光度计波长545nm比色，根据酚红标准曲线计算出酚红量。

注意事项：

1.待小鼠体内血液凝固后，再切开颈部，以免血液中酚红影响。

2.气道内注入NaHco3溶液后吸出时要轻轻进行，一旦用力过度，肺泡会破裂液体流入胸腔。

2）呼吸道纤毛运动实验法---鸽纤毛运动实验法原理：

利用气管纤毛运动带动颗粒物从气管内固定的向口腔方向的速度，测定药物祛痰药物，一般测运动2cm所需的时间.操作步骤：

鸽气管分离，做2cm的标记---切开气管，将软木屑放在2cm向心端--记录2cm所需时间，观察给药前后0.5h的速度，正常是3-4min。

注意事项：

鸽气管暴露实验注意温度，等待时颈部用生理盐水湿润纱布防治干燥.3）豚鼠气道黏液黏蛋白的测定.原理：

气道黏液主要由杯细胞和黏液性腺细胞产生和分泌，内含黏蛋白，为黏多糖和蛋白质。

无机酸存在下，己糖醛酸从黏多糖中释放与咔唑起缩合反应，形成有色物，在530nm比色测定.操作：

豚鼠麻醉处死，取气管称重----剪开气管用棉棒取黏液--水洗，离心，取上清液待用--上清加四硼酸-浓硫酸溶液，沸水加热15min--用分光光度计530nm比色。

4）大鼠气道黏液中肺表面活性物质的测定.原理：

肺表面活性物质（ps）由脂质和蛋白质组成，其中约90%是脂质，且绝大部分是定磷脂，因此磷脂的定量即可反应ps的多少。

操作：

制取支气管肺泡灌洗液--肺表面活性物质的测定---置620nm波长比色法定量。

五、镇痛药的药效实验方法？

具体有哪些实验方法？

分类：

化学刺激法，热刺激法，电刺激法，机械刺激法，慢性疼痛法、化学刺激法：

1.小鼠扭体法2.钾离子皮下透过法3.缓激肽动脉注射法4.福尔马林实验。

热刺激法：

1.辐射热刺激法2.小鼠热板法3.小鼠热水缩尾法电刺激法：

1.大鼠牙髓刺激法2.电刺激大鼠甩尾法。

机械刺激法：

1大鼠尾尖部压痛法2.小鼠尾根部、后肢加压法3.大鼠压足法慢性疼痛法：

1.大鼠关节炎痛2.神经源性疼痛3.坐骨神经痛4.癌痛模型六、肝纤维化模型1、CCL4诱发的肝纤维化动物模型原理CCL4CCL3.+CL.启动脂质过氧化作用损伤肝细胞操作：

SD大鼠、CCL4、花生油（高压灭菌）分组：

正常组、模型组、不同剂量的受试药物组、阳性对照药组背部皮下注射CCL42、异种血清诱发的肝纤维化动物模型原理：

异种血清进入动物体内引起免疫应答形成抗异种血清的抗体，长期刺激产生的免疫复合物来不及清除，沉积于肝脏的血管壁内外。

操作：

wistar雄大鼠、猪血清分组：

同上每只腹腔注射，，每次注0.5ml,每周2次，16周给药组给予相应药物血清，肝脏指标检查3、胆总管结扎致肝纤维化动物模型4、乙醇诱导的肝纤维化动物模型5、二甲基硝胺诱导的肝纤维化动物模型6、复合因素建立的肝纤维化动物模型七、发热模型、1.基本原理：

发热反应大多是各种致热因子作用于机体，产生和释放内热原，并进一步影响体温调节中枢，使调温起步点提高，体温相应升高。

因此，实验室常用有关的刺激因子激活产生内热原。

操作方法：

1测量体温，系将肛表涂上凡士林，使其润滑后插入动物肛门，兔一般插入3-4cm，大鼠插入2cm，放置3-5min后取出读数。

2.引起发热反应包括

（1）细菌培养液和内毒素引起的发热。

1）注射杀死的大肠埃希菌或乙型副伤寒沙门菌培养液2）注射伤寒-副伤寒菌苗3）注射腐败干草浸剂4）注射大肠埃希菌菌液5）注入伤寒沙门菌内毒素6）应用啤酒酵母悬液

（2）非感染性发热复制法1）化学刺激法：

给兔背部注射松节油0.4ml/kg或2%2,4-二硝基酚乙醇溶液亦用1%角叉菜胶0.1ml，于大鼠一侧后足趾皮下注射2）注入异性蛋白给兔肌注10%蛋白栋，剂量1.0g/kg，可在2-3h内引起体温显著升高3）温刺激法（3）实验性发热反应的影响因素1）动物特点的影响：

不同种属、年龄和形态特征，对发热有明显影响2）实验环境温度的影响：

实验环境的温度能明显影响发热的反应速度和强度3）实验动物活性的影响：

体温实验时，必须考虑到动物的活动情况4）致热物质的注入量和注射部位。

八、抗抑郁药模型1、应激模型a.大、小鼠强迫游泳实验动物在恶劣环境下会出现逃逸行为，当不能逃逸时便出现行为绝望。

大鼠强迫游泳实验是利用行为绝望建立的一种能有效的抗抑郁药的大鼠抑郁模型。

b.小鼠悬尾法是一种急性行为绝望模型，将小鼠倒挂后，其行为首先是拼命挣扎，企图逃脱，最后进入绝望而静止不动。

大多数抗抑郁药可以明显缩短其不动时间。

c.慢性不可预知性应激实验2.大鼠嗅球切除模型大鼠嗅球切除后许多行为发生改变，如自发活动增加，被动学习能力欠缺等，均可以被抗抑郁剂所逆转。

3.药物诱发的抑郁模型（利血平、5-HTP、色胺）利血平拮抗实验:

利血平是一种囊泡再摄取抑制剂，他使递质留在囊泡外，易被单胺氧化酶降解，从而使单胺，儿茶酚胺耗尽，动物出现上眼睑下垂、体温下降及强直症状，抗抑郁药能拮抗上述症状。

5-HTP诱导的甩头行为大鼠色胺惊厥增强实验4.大鼠隔离残杀行为模型、脑卒中后抑郁模型九、如何从脾脏中取T细胞：

超净台内无菌取小鼠脾脏，将脾脏转入pbs中，研磨制成单细胞悬液，，另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后加入制备的细胞悬液，离心，分层，吸出单个核细胞层在另外无菌试管中，用红细胞裂解液处理，以除去红细胞，离心，弃上清，采用尼龙毛柱法：

混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时，B细胞、浆细胞、单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上，而多数T细胞则通过尼龙毛柱，将注射器固定在支架上，倒入37℃的细胞培养液，关闭阀门一定时间，然后打开阀门，放掉细胞培养液，以清洗几次尼龙毛，关上阀门。

将要分离的细胞液用预先加温的培养液稀释成适当的浓度，约5.00×107个细胞／ml。

将细胞液倒入注射器内，使之没过尼龙毛柱。

盖上注射器，37℃温育45min至1h。

打开下口，缓慢放流，收集于离心管中。

离心，即获所需的T淋巴细胞。

十、肿瘤细胞的培养：

肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，首先癌细胞是比较容易培养的细胞。

当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。

另外肿瘤对人类是威胁最大的疾病。

肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。

肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。

一、组织培养肿瘤细胞生物学特性肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。

生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞，其差异较小，但也并非完全相同。

培养中的肿瘤细胞具以下突出特点：

－）形态和性状培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。

电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。

二）生长增殖肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。

正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长的因子，而癌细胞在低血清中（2%～5%）仍能生长。

已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。

正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长的现象，已成为检测细胞恶变的一个指标。

癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。

另外癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。

三）永生性永生性也称不死性。

在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡（Apoptosis）。

体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状，体内肿瘤细胞是否如此尚无直接证明。

四）浸润性浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，培养癌细胞仍持有这种性状。

在与正常组织混合培养时，能浸润入其它组织细胞中，并有穿透人工隔膜生长的能力。

五）异质性所有肿瘤都是由有增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成。

异质性构成同一肿瘤内细胞的活力有差别的瘤组织；处于瘤体周边区的细胞获得血液供应多，增殖旺盛，中心区有的细胞衰老退化，有的处于周期阻滞状态，那些呈活跃增殖状态的细胞称干细胞（StemCells）、只有这些干细胞才是支持肿瘤生长的成分。

六）其它肿瘤细胞在体外不易生长的原因可能由于：

①依赖性：

肿瘤细胞虽有较强克隆生长力，但仍有一定的群体性或与其它细胞相依存关系。

一是肿瘤细胞与肿瘤细胞的相互依存，二是肿瘤细胞与基质成纤维细胞的依赖。

体外分散培养和排除成纤维细胞后也会同时消除或减弱这些依存关系，可能