EMSAElectrophoretic Mobility Shift Assay电泳迁移率检测.docx

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EMSAElectrophoreticMobilityShiftAssay电泳迁移率检测

EMSA（ElectrophoreticMobilityShiftAssay）--电泳迁移率检测

凝胶迁移或电泳迁移率检测（ElectrophoreticMobilityShiftAssay，EMSA）是一种检测蛋白质和DNA序列相互结合的技术，最初用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用，可用于定性和定量分析。

这一技术目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用，已经成为转录因子研究的经典方法。

其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后。

该方法可用于检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白，并可通过加入特异性的抗体（supershift）来检测特定的蛋白质，并可进行未知蛋白的鉴定。

生物体内DNA转录成RNA是基因表达的关键过程，基因表达调控主要发生在转录水平。

近年来，基因分子生物学研究领域的趋势之一是逐渐从基因结构和功能分析转到基因顺式作用元件和转录因子及其转录调控机理上，对基因转录调控的研究将是今后相当长一段时期内功能基因组学研究的热点之一。

在转录水平，基因的转录行为是由顺式作用元件（cis-actingelements）和反式作用因子（trans-actingfactors）（即转录因子）相互作用调控的，因此要探讨基因的表达调控规律，分离、鉴定基因的位点控制区（locicontrolregion，LCR）中顺式作用元件和相应转录因子至关重要。

但仅仅如此还不够，对于基因表达调控，必须从三个层次展开：

一是分离和鉴定基因5＇端核心启动子等顺式作用元件，二是分离和鉴定与各顺式作用元件相对应的转录因子，三是检测各顺式作用元件与对应转录因子的相互作用。

鉴定顺式调控元件和转录因子是研究得比较多的内容，而对于顺式作用元件与对应转录因子的相互作用这个层次的研究相对较为薄弱。

电泳迁移率检测（ElectrophoreticMobilityShiftAssay,EMSA）是一种检测蛋白质和DNA序列相互结合的技术，它正是对第三个层次进行研究的技术之一，核心功能是验证蛋白质与特定核酸序列的结合特性，从而间接推断已知蛋白质的靶序列或已知序列的结合蛋白分子。

我们知道，结构基因组学已经很容易实现高通量分析，但在功能研究这个层次上，目前还没有真正高通量的分析技术出现。

技术的缺乏是后基因组学时代功能研究的主要瓶颈。

和其他功能研究技术一样，电泳迁移率检测（ElectrophoreticMobilityShiftAssay,EMSA）本身也存在诸多缺点，比如对于低亲和力结合很难进行鉴定；难以比较不同片断之间亲和力大小的差异；对于蛋白复合体与DNA的结合也无法鉴定。

由于体外环境和体内环境存在巨大的差异，电泳迁移率检测（ElectrophoreticMobilityShiftAssay,EMSA）很难真正重建体内蛋白质与DNA之间结合过程。

对EMSA进行改良或发展更好的研究蛋白质与DNA互作的技术很有必要。

简单说明一下EMSA技术的优缺点，基本原理和实验方法。

Electrophoreticmobilityshiftassay（EMSA）

Introduction

Advantage：

canseparatedifferenttypesofcomplexes,suchasmonomeranddimer=>betterthanfilterbinding

easiertoseethecomplexthanfootprintassay

Disadvantage:

donotknowwherethebindingsiteis.

Rationale

DNA-proteincomplexwillhaveasmallermobilitythanthatoffreeDNAonnativegel

gelelectrophoresisandmolecularsieve

cageeffect-differencebetweenfootprintandEMSA

Datainterpretation

nonspecificbinding

smearingbetweenDNAandcomplexbands

Methods

LableDNA

MixDNAandproteintoformcomplex

Addnonspecificcompetitor

Separatecomplexwithfreeprobeonanativegel

这里只提供了方法的基本的路线，具体操作可以参考：

http:

//www.protocol-online.org/cgi-bin/prot/search.cgi?

catid=&query=EMSA&submit2=Search

下面是在一个PROTOCAL

1.探针的标记：

（1）如下设置探针标记的反应体系：

待标记探针（1.75pmol/微升）2微升

T4PolynucleotideKinaseBuffer（10X）1微升

Nuclease-FreeWater5微升

[γ-32P]ATP（3,000Ci/mmolat10mCi/ml）1微升

T4PolynucleotideKinase（5-10u/微升）1微升

总体积10微升

按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4PolynucleotideKinase，混匀。

（2）使用水浴或PCR仪，37℃反应10分钟。

（3）加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。

（4）再加入89微升TE，混匀。

此时可以取少量探针用于检测标记的效率。

通常标记的效率在30％以上，即总放射性的30%以上标记到了探针上。

为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。

（5）标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。

标记好的探针可以保存在-20℃。

2.探针的纯化：

通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。

在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。

如需纯化，可以按照如下步骤操作：

（1）对于100微升标记好的探针，加入1/4体积即25微升的5M醋酸铵，再加入2体积即200微升的无水乙醇，混匀。

（2）在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜。

（3）在4℃，12,000g-16,000g离心30分钟。

小心去除上清，切不可触及沉。

（4）在4℃，12,000g-16,000g离心1分钟。

小心吸去残余液体。

微晾干沉淀，但不宜过分干燥。

（5）加入100微升TE，完全溶解沉淀。

标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。

标记好的探针可以保存在-20℃。

3.EMSA胶的配制：

（1）准备好倒胶的模具。

可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。

最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。

为得到更好的结果，可以选择可灌制较大EMSA胶的模具。

（2）按照如下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝胶（注意：

使用29:

1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大）。

TBEbuffer（10X）1毫升

重蒸水16.2毫升

39:

1acrylamide/bisacrylamide（40%，w/v）2毫升

80%甘油625微升

10%过硫酸铵（ammoniumpersulfate）150微升

TEMED10微升

（3）按照上述次序加入各个溶液，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。

避免产生气泡，并加上梳齿。

如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。

4.EMSA结合反应：

（1）如下设置EMSA结合反应：

阴性对照反应：

Nuclease-FreeWater7微升

EMSA/Gel-Shift结合缓冲液（5X）2微升

细胞核蛋白或纯化的转录因子0微升

标记好的探针1微升

总体积10微升

样品反应：

Nuclease-FreeWater5微升

EMSA/Gel-Shift结合缓冲液（5X）2微升

细胞核蛋白或纯化的转录因子2微升

标记好的探针1微升

总体积10微升

探针冷竞争反应：

Nuclease-FreeWater4微升

EMSA/Gel-Shift结合缓冲液（5X）2微升

细胞核蛋白或纯化的转录因子2微升

未标记的探针1微升

标记好的探针1微升

总体积10微升

突变探针的冷竞争反应：

Nuclease-FreeWater4微升

EMSA/Gel-Shift结合缓冲液（5X）2微升

细胞核蛋白或纯化的转录因子2微升

未标记的突变探针1微升

标记好的探针1微升

总体积10微升

Super-shift反应：

Nuclease-FreeWater4微升

EMSA/Gel-Shift结合缓冲液（5X）2微升

细胞核蛋白或纯化的转录因子2微升

目的蛋白特异抗体1微升

标记好的探针1微升

总体积10微升

（2）按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温（20-25℃）放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。

然后加入标记好的探针，混匀，室温（20-25℃）放置20分钟。

（3）加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液（无色，10X），混匀后立即上样。

注意：

有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。

如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至能观察到蓝颜色即可。

5.电泳分析：

（1）用0.5XTBE作为电泳液。

按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。

预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1X的EMSA上样缓冲液（蓝色），以观察电压是否正常进行。

（2）把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。

在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液（蓝色），用于观察电泳进行的情况。

（3）按照10V/厘米的电压电泳。

确保胶的温度不超过30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。

电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。

（4）剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。

小心取下夹有EMSA胶的胶板，用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边缘的电压液。

小心打开两块胶板中的上面一块（注：

通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板），把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶，轻轻把滤纸和胶压紧。

滤纸被胶微微浸湿后（大约不足1分钟），轻轻揭起滤纸，这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。

把滤纸侧向下，放平，在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜，确保保鲜膜和胶之间没有气泡。

（5）干胶仪器上干燥EMSA胶。

然后用X光片压片检测，或用其它适当仪器设备检测。

电泳迁移实验EMSA

1.核蛋白的提取

①用细胞刮子刮取RAW264.7细胞与VSMC，移入2.5mlEP管中。

②将细胞用冰冷PBS洗两遍，于4℃,5000g离心3min，沉淀细胞。

③加5倍细胞体积的冰浴缓冲液A洗细胞一次，于4℃,5000g离心3min沉淀细胞.④加3倍细胞体积的冰浴缓冲液A悬浮细胞，冰上放置30min、剧烈振荡10次，4℃,5000g离心15min，去上清，沉淀为细胞核。

⑤加与细胞等体积的冰浴缓冲液B，充分混匀，冰上放置30min后，于40℃,15000g离心15min,上清为核蛋白。

⑥取2μl核蛋白Bradford法测定核蛋白浓度，分装后于-70℃保存。

2.探针的标记与纯化

A、探针的标记:

将以下试剂加入冰浴中的0.5ml的EP管中，总体积20时。

①未标记的探针:

2μl（50ng）;②10x激酶缓冲液:

2g1;③[y-32P]ATP:

4μl（40uCi）;④T4多聚核甘酸激酶:

lμl（10U）;⑤超纯水:

11μl。

B.混匀后37℃水浴30分钟;

C、加入5μl1%SDS/100mMEDTA短暂涡旋混匀，以终止激酶反应;

3.探针的纯化

①准备MicroSpin'G25分离柱;②轻轻涡旋分离柱以重悬管内树脂;③将盖子拧松1/4后去掉管底密封;④将分离管放入一只1.5mlEP管中（EP管作支撑用）⑤735g离心1分钟;⑥加入样品:

⑦分离管放入一只新的1.5mlEP管中，缓慢将样品加入树脂床角度平面的中央，735g离心1分钟;⑧将75μl超纯水加入分离柱，735g离心1分钟;⑨收集支撑管内纯化好的探针，小心丢弃分离管。

4.测定探针的放射活性

取1μl纯化的探针，用闪烁计数器测量其放射活性，放射活性大于1*105cpm/μl示标记成功。

5.凝胶迁移阻滞法测定NF-KB

A、按下列顺序分别将各反应成分加入第一套做好标记的EP管内:

①结合缓冲液:

4μl②稳定液D:

2μl;③核提取物:

lug;④去离子水至:

16μl.

B、用移液枪轻轻吸打混匀，40℃下将核提取物预孵育20分钟，

C、在核提取物预孵育期间，按下列顺序依次将各成分加入做好标记的第二套EP管内:

①结合缓冲液:

2μl;②稳定液D:

1μl;③探针:

1μl;④去离子水:

4μl。

D、将探针棍合物加入预孵育好的核提取物混合物中，用移液器轻轻吸打混匀后，4℃继续孵育20分钟。

E、EMSA测定:

预先将5%非变性丙烯酞胺胶（38:

2）和电泳缓冲液（1XTGE）预冷至4℃,然后:

①将每反应管内所有反应物加入样品孔中。

同时在一空白孔中加入含溟酚蓝的上样缓冲液，以观测胶的移动情况。

当溟酚蓝电泳至玻璃板下1/3即可停止电泳（约2小时）。

②电泳:

12.5V/cm（16cm玻璃板为200V）。

F、放射自显影:

电泳完毕后，取出凝胶，用保鲜膜封好;将凝胶与放入有增感屏的曝光盒中，于-70℃放射自显影24小时。

然后将X光片在显影液中显影30sec-1min，在定影中定影15-30min，清水冲洗干净后自然晾干。

G、图像分析:

将各测量组的电泳照片扫描至计算机，然后应用Bandscan分析软件对电泳条带进行灰度测定，并计算平均光密度值（OD），以各条带的OD值表示相应核转录因子的活性。