EMSAElectrophoretic Mobility Shift Assay电泳迁移率检测.docx

1、EMSAElectrophoretic Mobility Shift Assay电泳迁移率检测EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assay)-电泳迁移率检测凝胶迁移或电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）是一种检测蛋白质和DNA序列相互结合的技术，最初用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用，可用于定性和定量分析。这一技术目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用，已经成为转录因子研究的经典方法。 其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋

2、白结合的探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后。该方法可用于检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白，并可通过加入特异性的抗体（supershift）来检测特定的蛋白质，并可进行未知蛋白的鉴定。 生物体内DNA转录成RNA是基因表达的关键过程，基因表达调控主要发生在转录水平。近年来，基因分子生物学研究领域的趋势之一是逐渐从基因结构和功能分析转到基因顺式作用元件和转录因子及其转录调控机理上，对基因转录调控的研究将是今后相当长一段时期内功能基因组学研究的热点之一。 在转录水平，基因的转录行为是由顺式作用元件（cis-acting elements）和反式作用因子（trans-acting facto

3、rs）（即转录因子）相互作用调控的，因此要探讨基因的表达调控规律，分离、鉴定基因的位点控制区（loci control region，LCR）中顺式作用元件和相应转录因子至关重要。但仅仅如此还不够，对于基因表达调控，必须从三个层次展开：一是分离和鉴定基因5端核心启动子等顺式作用元件，二是分离和鉴定与各顺式作用元件相对应的转录因子，三是检测各顺式作用元件与对应转录因子的相互作用。鉴定顺式调控元件和转录因子是研究得比较多的内容，而对于顺式作用元件与对应转录因子的相互作用这个层次的研究相对较为薄弱。电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）

4、是一种检测蛋白质和DNA序列相互结合的技术，它正是对第三个层次进行研究的技术之一，核心功能是验证蛋白质与特定核酸序列的结合特性，从而间接推断已知蛋白质的靶序列或已知序列的结合蛋白分子。 我们知道，结构基因组学已经很容易实现高通量分析，但在功能研究这个层次上，目前还没有真正高通量的分析技术出现。技术的缺乏是后基因组学时代功能研究的主要瓶颈。和其他功能研究技术一样，电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）本身也存在诸多缺点，比如对于低亲和力结合很难进行鉴定；难以比较不同片断之间亲和力大小的差异；对于蛋白复合体与DNA的结合也无法鉴定。由

5、于体外环境和体内环境存在巨大的差异，电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）很难真正重建体内蛋白质与DNA之间结合过程。对EMSA进行改良或发展更好的研究蛋白质与DNA互作的技术很有必要。简单说明一下EMSA技术的优缺点，基本原理和实验方法。 Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) Introduction Advantage： can separate different types of complexes, such as monomer and dimer = better t

6、han filter binding easier to see the complex than footprint assay Disadvantage: do not know where the binding site is. Rationale DNA-protein complex will have a smaller mobility than that of free DNA on native gel gel electrophoresis and molecular sieve cage effect - difference between footprint and

7、 EMSA Data interpretation nonspecific binding smearing between DNA and complex bands Methods Lable DNA Mix DNA and protein to form complex Add nonspecific competitor Separate complex with free probe on a native gel 这里只提供了方法的基本的路线，具体操作可以参考： http:/www.protocol-online.org/cgi-bin/prot/search.cgi?catid=

8、&query=EMSA&submit2=Search 下面是在一个PROTOCAL 1.探针的标记：（1）如下设置探针标记的反应体系： 待标记探针（1.75pmol/微升）2微升 T4 Polynucleotide Kinase Buffer （10X）1微升 Nuclease-Free Water 5微升 -32PATP（3,000Ci/mmol at 10mCi/ml）1微升 T4 Polynucleotide Kinase （5-10u/微升）1微升 总体积 10微升 按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4 Polynucleotide Kinase

9、，混匀。（2）使用水浴或PCR仪，37反应10分钟。（3）加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。 （4）再加入89微升TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30以上，即总放射性的30%以上标记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。 （5）标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20。 2. 探针的纯化： 通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化，可以按照如 下步骤操作： （1）对于100微升标记好的探针，加入1/4体积即25微升的5M

10、醋酸铵，再加入2体积即200微升的无水乙醇，混匀。 （2）在-70至-80沉淀1小时，或在-20沉淀过夜。 （3）在4，12,000g-16,000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉。（4）在4，12,000g-16,000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。 （5）加入100微升TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在 -20。3.EMSA 胶的配制： （1）准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以

11、选择可灌制较大 EMSA 胶的模具。 （2）按照如下配方配制20毫升4的聚丙烯酰胺凝胶（注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大）。 TBE buffer （10X）1毫升 重蒸水 16.2毫升 39:1 acrylamide/bisacrylamide （40%，w/v）2毫升 80% 甘油 625微升 10% 过硫酸铵 （ammonium persulfate）150微升 TEMED 10微升（3）按照上述次序加入各个溶液，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡， 并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃

12、板进行硅烷化处理。4.EMSA结合反应：（1）如下设置EMSA结合反应：阴性对照反应： Nuclease-Free Water 7微升 EMSA/Gel-Shift结合缓冲液（5X）2微升 细胞核蛋白或纯化的转录因子 0微升 标记好的探针 1微升 总体积 10微升样品反应： Nuclease-Free Water 5微升 EMSA/Gel-Shift结合缓冲液（5X）2微升 细胞核蛋白或纯化的转录因子 2微升 标记好的探针 1微升 总体积 10微升探针冷竞争反应： Nuclease-Free Water 4微升 EMSA/Gel-Shift结合缓冲液（5X）2微升 细胞核蛋白或纯化的转录因子

13、2微升 未标记的探针 1微升 标记好的探针 1微升 总体积 10微升突变探针的冷竞争反应： Nuclease-Free Water 4微升 EMSA/Gel-Shift结合缓冲液（5X）2微升 细胞核蛋白或纯化的转录因子 2微升 未标记的突变探针 1微升 标记好的探针 1微升 总体积 10微升Super-shift反应： Nuclease-Free Water 4微升 EMSA/Gel-Shift结合缓冲液（5X）2微升 细胞核蛋白或纯化的转录因子 2微升 目的蛋白特异抗体 1微升 标记好的探针 1微升 总体积 10微升（2）按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温（

14、20-25）放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温（20-25）放置20分钟。 （3）加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液（无色，10X），混匀后立即上样。注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建 议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至能观察到蓝颜色即可。 5.电泳分析： （1）用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以

15、加入少量稀释好的1X 的EMSA上样缓冲液（蓝色），以观察电压是否正常进行。 （2）把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液 （蓝色），用于观察电泳进行的情况。 （3）按照10V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓 冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。 （4）剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板，用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边 缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块（注

16、：通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板），把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶，轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后（大约不足1分钟），轻轻揭起滤纸，这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下，放平，在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜，确保保鲜膜和胶之间没有气泡。 （5）干胶仪器上干燥EMSA胶。然后用X光片压片检测，或用其它适当仪器设备检测。 电泳迁移实验 EMSA1 .核蛋白的提取用 细 胞 刮子刮取RAW264.7 细胞与VSMC ，移入2.5mlEP 管中。将细胞用冰冷PBS 洗两遍，于4 , 5000g 离心3min ，沉淀细胞。加5 倍细胞体积的冰浴缓冲液A 洗细胞一次

17、，于4 ,5000g 离心3 min 沉淀细胞. 加3 倍细胞体积的冰浴缓冲液A 悬浮细胞，冰上放置30min 、剧烈振荡10 次，4 ,5000g 离心15min ，去上清，沉淀为细胞核。加与细胞等体积的冰浴缓冲液B ，充分混匀，冰上放置30min 后，于40 ,15 000g 离心15min, 上清为核蛋白。取2l 核蛋白Bradford 法测定核蛋白浓度，分装后于-70 保存。2. 探针的标记与纯化A 、探针的标记: 将以下试剂加入冰浴中的0.5m l 的EP 管中，总体积20 时。未标记的探针:2l (50ng); 10 x 激酶缓冲液:2g 1; y-32PATP: 4l (40 u

18、Ci); T4 多聚核甘酸激酶:ll (10U); 超纯水:11l 。B. 混匀后37 水浴30 分钟;C 、加入5l 1%SDS/100 mM EDTA 短暂涡旋混匀，以终止激酶反应;3 .探针的纯化准 备 MicroSpin G25 分离柱; 轻轻涡旋分离柱以重悬管内树脂; 将盖子拧松1/4 后去掉管底密封; 将分离管放入一只1.5mlEP 管中(EP 管作支撑用) 735g 离心1分钟; 加入样品: 分离管放入一只新的1.5 mlEP 管中，缓慢将样品加入树脂床角度平面的中央，735g 离心1 分钟; 将75l 超纯水加入分离柱，735g 离心1 分钟; 收集支撑管内纯化好的探针，小心丢

19、弃分离管。4.测定探针的放射活性取1l 纯化的探针，用闪烁计数器测量其放射活性，放射活性大于1* 10 5 cpm/l 示标记成功。5.凝胶迁移阻滞法测定NF-KBA 、 按下 列 顺序分别将各反应成分加入第一套做好标记的EP 管内: 结合缓冲液:4l 稳定液D:2 l; 核提取物:lug; 去离子水至:16l.B 、用移液枪轻轻吸打混匀，40下将核提取物预孵育20 分钟，C 、在核提取物预孵育期间，按下列顺序依次将各成分加入做好标记的第二套EP 管内: 结合缓冲液:2l; 稳定液D:1l; 探针:1l; 去离子水:4l 。D 、将探针棍合物加入预孵育好的核提取物混合物中，用移液器轻轻吸打混匀

20、后，4 继续孵育20 分钟。E、EMSA 测定: 预先将5% 非变性丙烯酞胺胶(38:2 ) 和电泳缓冲液(1X TGE) 预冷至4 , 然后: 将每反应管内所有反应物加入样品孔中。同时在一空白孔中加入含溟酚蓝的上样缓冲液，以观测胶的移动情况。当溟酚蓝电泳至玻璃板下1/3 即可停止电泳( 约2 小时) 。电泳:12.5V/cm(16cm 玻璃板为200V)。F 、放射自显影: 电泳完毕后，取出凝胶，用保鲜膜封好; 将凝胶与放入有增感屏的曝光盒中，于-70 放射自显影24 小时。然后将X 光片在显影液中显影30sec-1min ，在定影中定影15-30min ，清水冲洗干净后自然晾干。G 、图像分析: 将各测量组的电泳 照片扫描至计算机，然后应用Bandscan 分析软件对电泳条带进行灰度测定，并计算平均光密度值(OD) ，以各条带的OD 值表示相应核转录因子的活性。