分子试验手册.docx

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分子试验手册

一、样品的准备

采样准备：

布袋，剪刀，手术刀，样品袋，液氮，以上东西需经过高压灭菌。

采样过程：

采样时不要说话，佩戴乳胶手套，迅速采集小块组织装入样品袋或锡箔纸包装后，快速放入液氮，放时注意样品的充分冷却，回到实验室放入-70度。

注意采样时注意要迅速，以防RNA降解。

二、RNA提取

1、准备东西：

高速冷冻离心机、低温冰箱、核酸电泳设备、液氮罐、研钵、剪刀、镊子，蓝黄枪头。

2、使用器具

尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前安下列方法进行处理

试剂配制及器具处理

①0.1％的DEPC（焦碳酸二乙酯））水

②器具处理：

试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml的EP管等用纱布包裹，在0.1％的DEPC水中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。

剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。

③无RNA酶灭菌水（DEPC处理过的水）：

用将高温烘烤的玻璃瓶装重蒸馏水，按0.01%（体积/体积）加入的DEPC处理过夜，拧松瓶盖，高压灭菌。

80℃烘4h以上。

④Trizol

⑤75%乙醇：

用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。

⑥氯仿

⑦异丙醇

3、操作步骤（具体需要参照产品说明书）

Trizol法提取总RNA

①先在研钵中加入液氮，再将组织剪成小块在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意组织粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。

②室温放置5min，然后加入200µl的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。

③12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500µl异丙醇，温和颠倒混匀。

室温放置10min，12000rpm离心10min。

④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。

⑤重复步骤④。

⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。

用30µlDEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。

RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。

[注意]

①整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。

②加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。

琼脂糖凝胶电泳检测RNA

三、RT-PCR扩增目的基因cDNA

1、试剂

①RNA模板

②Olig（dT）18

③反转录缓冲液

④dNTP

⑤M-MULV反转录酶

⑥RNA抑制剂（RNasin）

⑦PfuDNA聚合酶或TaqDNA聚合酶

⑧10×PCRbuffer

⑨特异引物（PCR）

2、设备

PCR扩增仪、电泳仪、台式离心机、恒温水浴、微量移液器，DEPC处理的枪头。

3、操作步骤

3.1RNA的反转录

①在小EP管中依次加入

RNA模板3μl（依据RNA浓度加）

Olig（dT）18引物1μL

DEPCH2O8μL

混合后，70℃水浴5min（破坏二级结构），再冰浴5min，瞬时离心收集液滴。

②在管中依次加入（反应体系为20μL）：

RT5×buffer4μL

RNasin1μL

dNTP（10mM）2μL

混匀，37℃5min。

M-MULV反转录酶1μL

置于42℃，1h。

③70℃保温5min（使酶失活）。

④于-20℃保存备用。

3.2PCR扩增目的基因

3.2.1用克隆引物扩增目的基因

在灭菌的PCR管中，依次加入（50ul体系）

模板（反转录产物）1μl

10×PCR缓冲液3μl

dNTP0.5μl

克隆引物B11μl

克隆引物B21μl

PfuDNA聚合酶0.5μl

ddH2O23μl

混匀后按下面的设置程序进行扩增。

94℃3min

94℃45Sec

30cycles:

55℃45Sec

72℃45Sec（依据片断大小设置，经验数据500bp/30sec）

72℃5min

PCR产物进行1%琼脂糖电泳分析鉴定，同时进行回收（参见附录1）。

四、核酸琼脂糖电泳分析

1、试剂

①TBE缓冲液（10×）：

用时需稀释10倍

②点样缓冲液Loadingbuffer（10×）：

0.25%溴酚蓝，40%甘油

③溴乙啶染色液（EB）：

10mg/ml溴乙啶。

注意：

EB具致癌作用。

④琼脂糖

2、器材

电泳仪系统、凝胶成像系统

3、操作步骤

3.1琼脂糖凝胶的制备

称0.2g琼脂糖加入20mlTBE缓冲液中加热熔解，放置至手背不烫时加入EB或者后边浸泡。

3.2胶板制备

将凝胶槽清洗干净，在一端插好梳子。

然后倒入熔化好的琼脂糖，待凝胶完全凝固后，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入TBE缓冲液），拔掉梳子。

注意：

缓冲液要高出胶面2mm。

3.3点样

每个样品中加入1/10体积Loadingbuffer（10×），混匀后小心地加入点样孔中，要避免相互污染。

3.4电泳

接通电源，80V电压电泳1h左右，当溴酚蓝到达下沿1~2㎝处时终止电泳。

3.5观察及照相

将胶板拿出，在EB溶液中浸泡数分钟后，用凝胶成像系统照相。

五、PCR产物纯化

参照安徽优晶说明书：

使用前应准备的材料：

·10,000xg的以上离心机

·1.5ml灭菌离心管

·无菌去离子水或TE缓冲液

·无水乙醇

·防护眼镜

回收纯化操作方案：

请您在正式操作之前仔细阅读本说明书确保完全熟悉操作方案，该试剂盒设计简单、快速、可靠，且为您提供了所有的操作步骤，所有的离心步骤都必须在室温下进行。

1、进行琼脂糖凝胶－EB电泳以分析PCR产物。

2、确定PCR反应产物体积，将PCR产物转移至一个1.5ml离心管中，加入等体积的PP-II缓冲液。

对于小于200bp以下PCR产物需要加2倍体积的PP-II缓冲液，旋涡混匀。

3、将样本加入到一个Mu-PuDNA回收纯化柱上，柱子事先装在一个干净的2ml收集管内，室温下10,000xg离心1分钟，弃去流出液。

4、用700ul已用无水乙醇稀释SPW洗涤缓冲液洗涤柱子，室温下10000xg离心1分钟。

注意：

SPW洗涤缓冲液在使用前必须按瓶上标签提示用无水乙醇稀释。

5、弃去流出液，重复第4步一次。

6、弃去流出液，将空柱10,000xg离心1分钟，以甩干柱子基质。

此步对于从柱上去除乙醇相当重要，否则会影响到下游的应用。

7、把柱子装在一个灭菌干净的1.5ml离心管上，加入30-50μl（取决于最终产物的浓度）无菌去离子水或TE缓冲液到柱子上，10,000xg离心1分钟洗脱出DNA，这样可以得到80-90%的结合DNA，如果再进行一次洗脱，可以把残余的DNA洗脱出来，只是浓度较低。

8、DNA的产量和质量

把提取得到的样品稀释一定倍数后，分别在260mm和280mm下测光吸收值，回收得到DNA浓度下按下列公式计算：

[DNA浓度]=A260×50×稀释倍数ug/ml

长度大于500bp的片段回收率可大于80%，而50bp-500bp的片段只能达到60%-90%。

A260/A280值代表核酸纯度，如果比值大于1.8，则意味着核酸纯度大于90%，另一方面，产量高低有时也取决于琼脂糖凝胶-EB电泳。

六、载体和外源DNA的连接反应

1、试剂

①目标DNA片段（PCR扩增产物）

②载体（pMD18-T,pGEX4T-1）

③10×ligation缓冲液

④T4DNA连接酶

⑤ddH2O

2、设备

台式离心机、恒温水浴、微量移液器

3、操作步骤

4、克隆载体与目的片断的连接

取一个200µl的EP管依次加入下列试剂：

pMD18-T1μl

目的片段4μll

SolutionⅠ（含连接酶和buffer）5μl

离心30Sec，使反应体系充分混合，4℃过夜（12小时）连接。

5、表达载体与目的片断的连接

取一个200µl的EP管依次加入下列试剂：

2×buffer：

5μl

pGEX4T-1酶切回收产物：

1μl

Pfu扩增并酶切回收的片段：

3μl

T4连接酶：

1μl

离心30Sec，使反应体系充分混合，16～22℃连接3～4h。

七、感受态细胞的制备及转化

（CaCl2方法）

1、实验材料

大肠杆菌DH5α或BL21（DE3）PlysS

2、试剂

①LB培养基（液体和固体培养基配置方法参见附录2）

②氨苄青霉素

3、设备

培养皿、带帽试管、涂布器、冷冻离心机、无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等）、恒温摇床

4、操作步骤

4.1感受态的制备

①从LB平板上挑取单克隆于5mlLB培养基中，37℃200rpm摇菌12～16h。

②将活化过的菌按1％的体积比接种到新的LB液体培养基中，37℃200rpm摇菌约2h，OD600约为0.4（小于0.4都可）。

（感受态是一种能吸收外源物质的生长状态，因此OD值不能过了）。

③菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min。

④6000转/min，离心10min。

⑤倒出培养液，将管倒置1min，以使流尽培养液

6.用冰冷0.1mol/LCaCl2（灭菌预冷）10ml温和悬浮沉淀，立即放于冰上保温30min.

7.0-4度4000转/min，离心10min。

8.用冰冷的CaCl2（灭菌预冷）2ml温和悬浮细胞（务必放于冰上）

9.冻存时每4mlCaCl2加140ulDMSO

10.冰上放置15min后再加140ulDMSO

11冰上放置15min后200ul分装。

注意：

①无菌操作和保持低温。

②培养物处于对数生长期是制备感受态细胞的关键。

③如果要求高转化效率，不建议使用简单深冻保存的感受态细胞。

4.2转化

①将盛有感受态细胞的EP管放置于冰上10min，加入10μl连接产物（若加质粒，则只需加1μl），温和混匀，冰浴20~30min。

②42℃热激90S。

冰浴1-2min。

③加入800μLLB液体培养基，37℃培养60min。

使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性基因。

4.将适当体积的（90mm平板达200ul）已转化的感受态转移到含有抗生素的LB培养基上。

④取含有50～100μg/mlAmp的LB平板培养基（若进行蓝白斑筛选，在培养皿上先涂布4μl200mg/ml的IPTG和40μl20mm/ml的X-Gal），涂板。

⑤37℃倒置培养12~16h。

八、克隆的筛选和快速鉴定

1、试剂

①TaqDNA聚合酶

②10×buffer（含MgCl2）

③dNTP

④Loadingbuffer

2、设备

电泳仪、1.5mlEP管、培养皿、PCR扩增仪、台式离心机

3、操作步骤

7.3.2菌落PCR鉴定法

直接用接种针或牙签挑取少许菌体加入25μ的PCR反应体系中。

参照自己PCR体系加样。

试剂

体积（30μl）

ddH2O

22.5μl

10×buffer

3μl

dNTP

1μl

克隆引物B1

1μl

克隆引物B2

1μl

模板（单菌落）

1个

Taq酶（2.5u）

0.5μl

用特异引物进行PCR，电泳检测PCR产物，挑选对应的阳性克隆菌落。

做如下记录：

九、提取质粒

参考优晶提取质粒说明书：

使用者需备：

10,000xg以上高速离心机

1.5ml的灭菌干净小离心管

灭菌去离子水（或TE缓冲液）

无水乙醇（96%~100％）

15ml离心管及其配套离心机（仅ZL-2-1和ZL-2-2）

注

意

一、使用前往准备好的ZL-I缓冲液中加入RNaseA，保存于4℃。

二、DNA洗涤缓冲液需用无水乙醇按如下稀释：

ZL-1-1-1ZL-1-2-1

ZL-2-1-1ZL-2-2-1加入12ml无水乙醇

ZL-1-1-2ZL-1-2-2

ZL-2-1-2ZL-2-2-2加入80ml无水乙醇

ZL-1-1-3ZL-1-2-3

ZL-2-1-3ZL-2-2-3每瓶各加入80ml无水乙醇

三、稀释后的DNA洗涤缓冲液需室温保存；

四、所有步骤必须在室温下操作。

H.Q.&Q.质粒微量提取方案

产品编号：

ZL-1-1和ZL-1-2

A．样本准备

将带有目的质粒的E.coli接种于裝有5mlLB/氨苄青霉素（50μg/ml）培养基的10~20ml培养管中，37℃搖床培养12~16hr，以扩增质粒。

注意不要于37℃下培养菌种时间过长或长时间存放培养物，这对质粒分离的产量是不利的。

建议使用endA敏感型的E.coli菌株来作常规质粒的分离，例如DH5α®和JM109®等菌株。

B．操作方案

1.取1.5~5ml的菌液，于室温下10,000xg离心1min以沉淀菌种。

2.倒出或吸出培养基，弃去。

往沉淀中加入250μl的ZL-I／RNaseA混和液，漩涡振荡使细胞完全重新悬浮。

细胞沉淀的完全重悬对于获得高的产量是十分重要的。

3.往重悬混和液中加入250μlZL-II，轻轻翻转试管4~6次混和溶液，以获得一澄清的裂解液。

如有必要，可把裂解液置于室温静置2min。

避免剧烈混和裂解液，否则会使染色体DNA断裂而使得到的质粒纯度降低。

当使用完ZL-II以后，须盖紧其瓶盖保存好。

4.往上述混和液中加入350ulZL-III，并温和地上下颠倒离心管数次，直至形成白色絮狀沉淀。

于室温下10,000xg离心10min。

5.取一干净的Mu-Pu质粒微量分离柱裝在一个2ml收集试管上（已备）。

小心吸出上清，并将其转至于柱子內，确保转至柱內的上清中没有细胞杂质沉淀。

于室温下10,000xg离心1min，使裂解液完全流过柱子。

6.弃去离心甩出液，加入500μl的ZL缓冲液到柱子上，室温下10,000xg离心1min洗涤柱子，确保除去残余的蛋白质以得到后面操作所需的高质量DNA。

如果下游应用所要求的质粒质量不高，这一步可以省略。

7．弃去收集液，加入720μl用无水乙醇稀释的DNA洗涤缓冲液洗涤柱子，室温10,000xg离心10min，

弃去洗涤液。

注意：

浓缩的DNA洗涤缓冲液在使用之前必须按标签的提示用乙醇稀释。

如果DNA洗涤缓冲液在使用之前是置于冰箱中的，须将其拿出置于室温下。

8.可选做步骤：

重复步骤7，再用720μl的DNA洗涤缓冲液洗涤柱子一次。

9.室温下10,000xg离心空柱1min以甩干柱子基质。

注意：

不要忽略此步――这对从柱子上除去乙醇至关重要。

10.把柱子置于一干净的1.5ml小离心管上，直接加入50~100μl灭菌去离子水或TE缓冲液液到柱子基质上（所加的量取决于预期终产物浓度），10,000xg离心1min以洗脱出DNA。

这样，可得到大约75~80％的结合DNA，若进行第二次洗脱则可得到大部分残余的DNA，只是浓度较低。

DNA的产量与质量：

适当稀释样品（20~50倍），测量其在260nm和280nm下处的吸光值。

质粒浓度可按下列公式算出:

[DNA浓度]=A260×50×（稀释倍数）μg/ml

一般，高拷贝质粒培养物的DNA总产量可达到25μg/5ml。

用A260与A280的比值可显示核酸的纯度，若其比值大于1.8，表示核酸浓度大于90%。

另一方面，DNA的质量和数量可通过琼脂糖/EB电泳后与已知浓度的标准样品对照而很好地反映出来。

一般地，提取到的DNA大部分是超螺旋单体结构，尽管多聚体也同时存在。

十、测序分析

测序后，把序列方到NCBI检索比对：

首先打开首页：

http:

//www.ncbi.nlm.nih.gov/

点击：

BLAST：

http:

//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

然后到如下页面：

在红色框输入序列，或者通过下边浏览找到目的序列

选择数据库：

一般选择NR数据库

点击：

BLAST

接下来进入的页面有如下结果：

这张图是数据库信息：

这是一张总图：

这是一些详细点的信息：

下图是详细的碱基匹配情况：

　Identities:

同源性　Gaps空缺，即缺失碱基

　Strand即输入序列与数据库中序列的方向性：

　Plus:

正向

　Minus：

反向

如进行两序列比对：

http:

//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/bl2seq/wblast2.cgi

在下列框中输入需要比对的两个序列，然后点击ALign

当然我们需要的最多的可能是猪的数据库：

举例如下：

在这个网址http:

//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

点击突下红色区域：

即进入下面网址：

http:

//www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/

点击红色区域，乃进入猪数据库

下面进入下面的网页：

可供选的德数据库:

目前咱们实验室最多可能使用的是EST，HTGS，估计后面会用到RNA，protein数据库。

现在目前由于小鼠和人类基因组计划的完成，和研究的深入，许多基因已经完成，但是猪上边好多目前还没有基因全长，下面举一个利用人或小鼠的全长WNT10基因CDS，（即编码蛋白质的，开放阅读框，ORF）

在上述BLASTpigSequences输入小鼠wnt10全长：

选择EST数据库

点击：

进入如下界面：

我个人喜欢选择红色的，比较直观，

然后点击绿色方框：

进而进入如下界面：

这是总的信息：

这是详细信息:

据资料显示EST（表达序列标签）准确率在97%，

即我们可及根据猪的序列设计引物PCR。

分子生物学方用试剂配方：