分子试验手册.docx

1、分子试验手册一、样品的准备 采样准备：布袋，剪刀，手术刀，样品袋，液氮，以上东西需经过高压灭菌。采样过程：采样时不要说话，佩戴乳胶手套，迅速采集小块组织装入样品袋或锡箔纸包装后，快速放入液氮，放时注意样品的充分冷却，回到实验室放入-70度。注意采样时注意要迅速，以防RNA降解。二、RNA提取1、准备东西：高速冷冻离心机、低温冰箱、核酸电泳设备、液氮罐、研钵、剪刀、镊子，蓝黄枪头。2、使用器具尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前安下列方法进行处理试剂配制及器具处理 0.1的DEPC（焦碳酸二乙酯）)水 器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包

2、裹，在0.1的DEPC水中浸泡过夜（37），高压灭菌，80烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160烘烤6h以上。 无RNA酶灭菌水（DEPC处理过的水）：用将高温烘烤的玻璃瓶装重蒸馏水，按0.01%（体积/体积）加入的DEPC处理过夜，拧松瓶盖，高压灭菌。80烘4h以上。 Trizol 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 氯仿 异丙醇3、操作步骤（具体需要参照产品说明书）Trizol法提取总RNA 先在研钵中加入液氮，再将组织剪成小块在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50100mg组织粉末加入已盛有1

3、ml的Trizol液的EP管中（注意组织粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。 室温放置5min，然后加入200l的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500l异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm离心10min。 小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4下12000rpm离心5min。 重复步骤。 弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥510min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30l

4、 DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可5560水浴 10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70。注意 整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。 加氯仿前的匀浆液可在-70保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4保存一周，-20保存一年。琼脂糖凝胶电泳检测RNA 三、RT-PCR扩增目的基因cDNA1、试剂 RNA模板 Olig（dT）18 反转录缓冲液 dNTP M-MULV反转录酶 RNA抑制剂（RNasin） Pfu DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶 10PCR buffer 特异引物（PCR）2、 设备PCR扩增仪、电泳仪、台式离心机、

5、恒温水浴、微量移液器，DEPC处理的枪头。3、操作步骤3.1 RNA的反转录 在小EP管中依次加入RNA模板 3 l（依据RNA浓度加）Olig（dT）18引物 1LDEPC H2O 8 L混合后，70水浴5 min（破坏二级结构），再冰浴5min，瞬时离心收集液滴。 在管中依次加入 (反应体系为20 L)：RT 5buffer 4LRNasin 1LdNTP ( 10mM) 2L混匀，37 5min。M-MULV反转录酶 1 L置于 42，1h。 70保温5min（使酶失活）。 于-20保存备用。3.2 PCR扩增目的基因3.2.1 用克隆引物扩增目的基因在灭菌的PCR管中，依次加入（50u

6、l体系）模板（反转录产物） 1l 10PCR缓冲液 3ldNTP 0.5l克隆引物B1 1l克隆引物B 2 1lPfu DNA聚合酶 0.5l dd H2O 23l混匀后按下面的设置程序进行扩增。94 3 min 94 45Sec 30 cycles: 55 45Sec 72 45Sec（依据片断大小设置，经验数据500bp/30sec） 72 5minPCR产物进行1%琼脂糖电泳分析鉴定，同时进行回收（参见附录1）。四、核酸琼脂糖电泳分析1、试剂 TBE缓冲液（10）：用时需稀释10倍 点样缓冲液Loading buffer（10）：0.25%溴酚蓝，40%甘油 溴乙啶染色液(EB)：10m

7、g/ml溴乙啶。注意：EB具致癌作用。 琼脂糖2、器材电泳仪系统、凝胶成像系统3、操作步骤3.1 琼脂糖凝胶的制备称0.2g琼脂糖加入20ml TBE缓冲液中加热熔解，放置至手背不烫时加入EB或者后边浸泡。3.2 胶板制备将凝胶槽清洗干净，在一端插好梳子。然后倒入熔化好的琼脂糖，待凝胶完全凝固后，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入TBE缓冲液），拔掉梳子。注意：缓冲液要高出胶面2mm。3.3 点样每个样品中加入1/10体积Loading buffer（10），混匀后小心地加入点样孔中，要避免相互污染。3.4 电泳接通电源，80V电压电泳1h左右，当溴酚蓝到达下沿12处时终止电泳。3.5 观察及照相

8、将胶板拿出，在EB溶液中浸泡数分钟后，用凝胶成像系统照相。五、PCR产物纯化参照安徽优晶说明书：使用前应准备的材料：10,000xg的以上离心机1.5ml灭菌离心管无菌去离子水或TE缓冲液无水乙醇防护眼镜回收纯化操作方案：请您在正式操作之前仔细阅读本说明书确保完全熟悉操作方案，该试剂盒设计简单、快速、可靠，且为您提供了所有的操作步骤，所有的离心步骤都必须在室温下进行。1、 进行琼脂糖凝胶EB电泳以分析PCR产物。2、 确定PCR反应产物体积，将PCR产物转移至一个1.5ml离心管中，加入等体积的PP-II缓冲液。对于小于200bp以下PCR产物需要加2倍体积的PP-II缓冲液，旋涡混匀。3、

9、将样本加入到一个Mu-Pu DNA回收纯化柱上，柱子事先装在一个干净的2ml收集管内，室温下10,000xg离心1分钟，弃去流出液。4、 用700ul已用无水乙醇稀释SPW洗涤缓冲液洗涤柱子，室温下10000xg离心1分钟。注意：SPW洗涤缓冲液在使用前必须按瓶上标签提示用无水乙醇稀释。5、 弃去流出液，重复第4步一次。6、 弃去流出液，将空柱10,000xg 离心1分钟，以甩干柱子基质。此步对于从柱上去除乙醇相当重要，否则会影响到下游的应用。7、 把柱子装在一个灭菌干净的1.5ml离心管上，加入30-50l(取决于最终产物的浓度)无菌去离子水或TE缓冲液到柱子上，10,000xg离心1分钟洗

10、脱出DNA，这样可以得到80-90%的结合DNA，如果再进行一次洗脱，可以把残余的DNA洗脱出来，只是浓度较低。8、 DNA的产量和质量把提取得到的样品稀释一定倍数后，分别在260mm和280mm下测光吸收值，回收得到DNA浓度下按下列公式计算：DNA浓度=A260 50 稀释倍数 ug/ml长度大于500bp的片段回收率可大于80%，而50bp-500bp的片段只能达到60%-90%。A260/A280值代表核酸纯度，如果比值大于1.8，则意味着核酸纯度大于90%，另一方面，产量高低有时也取决于琼脂糖凝胶-EB电泳。六、载体和外源DNA的连接反应1、试剂 目标DNA片段（PCR扩增产物） 载

11、体（pMD18-T, pGEX 4T-1） 10ligation 缓冲液 T4 DNA连接酶 ddH2O2、设备台式离心机、恒温水浴、微量移液器3、操作步骤4、克隆载体与目的片断的连接取一个200l的EP管依次加入下列试剂：pMD18-T 1 l目的片段 4llSolution (含连接酶和buffer) 5 l离心30Sec，使反应体系充分混合，4过夜（12小时）连接。5、 表达载体与目的片断的连接取一个200l的EP管依次加入下列试剂：2buffer： 5 lpGEX 4T-1酶切回收产物： 1 lPfu扩增并酶切回收的片段： 3lT4连接酶： 1 l离心30Sec，使反应体系充分混合，1

12、622连接34h。七、感受态细胞的制备及转化（CaCl2方法）1、实验材料大肠杆菌DH5或BL21（DE3）PlysS2、 试剂 LB培养基（液体和固体培养基配置方法参见附录2） 氨苄青霉素3、 设备培养皿、带帽试管、涂布器、冷冻离心机、无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等）、恒温摇床4、 操作步骤4.1 感受态的制备 从LB平板上挑取单克隆于5ml LB培养基中，37 200rpm摇菌1216h。 将活化过的菌按1的体积比接种到新的LB液体培养基中，37 200rpm摇菌约2h，OD600约为0.4(小于0.4都可)。（感受态是一种能吸收外源物质的生长状态，因此OD值不能过了）。 菌液转

13、移到50ml 离心管中，冰上放置10min。 6000转/min，离心10min。倒出培养液，将管倒置1min，以使流尽培养液6.用冰冷0.1mol/LCaCl2（灭菌预冷）10ml温和悬浮沉淀，立即放于冰上保温30min.7.0-4 度4000转/min，离心10min。8.用冰冷的CaCl2（灭菌预冷）2ml温和悬浮细胞(务必放于冰上)9.冻存时每4mlCaCl2加140ulDMSO10.冰上放置15min后再加140ulDMSO11冰上放置15min后200ul分装。注意： 无菌操作和保持低温。 培养物处于对数生长期是制备感受态细胞的关键。 如果要求高转化效率，不建议使用简单深冻保存的感

14、受态细胞。4.2转化 将盛有感受态细胞的EP管放置于冰上10min，加入10l连接产物（若加质粒，则只需加1l），温和混匀，冰浴2030min。 42热激90S。冰浴1-2min。 加入800L LB液体培养基，37培养60min。使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性基因。4.将适当体积的（90mm平板达200ul）已转化的感受态 转移到含有抗生素的LB培养基上。 取含有50100g/ml Amp的LB平板培养基（若进行蓝白斑筛选，在培养皿上先涂布4l 200mg/ml的IPTG和40l 20mm/ml的X-Gal），涂板。 37倒置培养1216h。八、克隆的筛选和快速鉴定1、 试剂 Taq

15、DNA聚合酶 10buffer（含MgCl2） dNTP Loading buffer2、 设备电泳仪、1.5ml EP管、培养皿、PCR扩增仪、台式离心机3、 操作步骤7.3.2 菌落PCR鉴定法直接用接种针或牙签挑取少许菌体加入25的PCR反应体系中。参照自己PCR体系加样。试剂体积（30l）ddH2O22.5l10buffer3ldNTP1l克隆引物B11l克隆引物B21l模板(单菌落)1个Taq 酶(2.5u )0.5l用特异引物进行PCR，电泳检测PCR产物，挑选对应的阳性克隆菌落。做如下记录：九、提取质粒参考优晶提取质粒说明书：使用者需备： 10,000xg以上高速离心机1.5ml

16、的灭菌干净小离心管灭菌去离子水(或TE缓冲液)无水乙醇(96%100)15ml离心管及其配套离心机（仅ZL-2-1和ZL-2-2）注意一、使用前往准备好的ZL-I缓冲液中加入RNase A，保存于4。二、DNA洗涤缓冲液需用无水乙醇按如下稀释： ZL-1-1-1 ZL-1-2-1 ZL-2-1-1 ZL-2-2-1 加入12ml 无水乙醇 ZL-1-1-2 ZL-1-2-2 ZL-2-1-2 ZL-2-2-2 加入80ml 无水乙醇ZL-1-1-3 ZL-1-2-3ZL-2-1-3 ZL-2-2-3 每瓶各加入80ml 无水乙醇三、稀释后的DNA洗涤缓冲液需室温保存；四、所有步骤必须在室温下操

17、作。H.Q.&Q. 质粒微量提取方案产品编号： ZL-1-1和ZL-1-2A 样本准备将带有目的质粒的E. coli 接种于裝有5ml LB/氨苄青霉素(50g/ml)培养基的1020ml培养管中，37搖床培养1216 hr，以扩增质粒。注意不要于37下培养菌种时间过长或长时间存放培养物，这对质粒分离的产量是不利的。建议使用endA 敏感型的E. coli 菌株来作常规质粒的分离，例如DH5 和JM109等菌株。B操作方案1. 取1.55ml的菌液，于室温下10,000xg离心1min以沉淀菌种。2. 倒出或吸出培养基，弃去。往沉淀中加入250l的ZL-IRNaseA混和液，漩涡振荡使细胞完全

18、重新悬浮。 细胞沉淀的完全重悬对于获得高的产量是十分重要的。3. 往重悬混和液中加入250l ZL-II，轻轻翻转试管46次混和溶液，以获得一澄清的裂解液。 如有必要，可把裂解液置于室温静置2min。 避免剧烈混和裂解液，否则会使染色体DNA断裂而使得到的质粒纯度降低。 当使用完ZL-II以后，须盖紧其瓶盖保存好。4. 往上述混和液中加入350ul ZL-III，并温和地上下颠倒离心管数次，直至形成白色絮狀沉淀。于室温下10,000xg离心10min。5. 取一干净的Mu-Pu质粒微量分离柱裝在一个2ml收集试管上(已备)。小心吸出上清，并将其转至于柱子內，确保转至柱內的上清中没有细胞杂质沉淀

19、。于室温下10,000xg离心1min，使裂解液完全流过柱子。6. 弃去离心甩出液，加入500l的ZL缓冲液到柱子上，室温下10,000xg 离心1min洗涤柱子，确保除去残余的蛋白质以得到后面操作所需的高质量DNA。 如果下游应用所要求的质粒质量不高，这一步可以省略。7 弃去收集液，加入720l用无水乙醇稀释的DNA洗涤缓冲液洗涤柱子，室温10,000xg离心10min，弃去洗涤液。 注意：浓缩的DNA洗涤缓冲液在使用之前必须按标签的提示用乙醇稀释。如果DNA洗涤缓冲液在使用之前是置于冰箱中的，须将其拿出置于室温下。8. 可选做步骤：重复步骤7，再用720l的 DNA洗涤缓冲液洗涤柱子一次。

20、9. 室温下10,000xg离心空柱1min以甩干柱子基质。 注意：不要忽略此步这对从柱子上除去乙醇至关重要。10. 把柱子置于一干净的1.5ml小离心管上，直接加入50100l灭菌去离子水或TE缓冲液液到柱子基质上（所加的量取决于预期终产物浓度），10,000xg离心1min以洗脱出DNA。 这样，可得到大约7580的结合DNA，若进行第二次洗脱则可得到大部分残余的DNA，只是浓度较低。DNA的产量与质量： 适当稀释样品（2050倍），测量其在260nm和280nm下处的吸光值。质粒浓度可按下列公式算出: DNA浓度 = A26050（稀释倍数） g/ml一般，高拷贝质粒培养物的DNA总产量

21、可达到25g/5ml。用A260与A280的比值可显示核酸的纯度，若其比值大于1.8，表示核酸浓度大于90%。另一方面，DNA的质量和数量可通过琼脂糖/EB电泳后与已知浓度的标准样品对照而很好地反映出来。一般地，提取到的DNA大部分是超螺旋单体结构，尽管多聚体也同时存在。十、测序分析测序后，把序列方到NCBI检索比对：首先打开首页：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/点击：BLAST：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/然后到如下页面：在红色框输入序列，或者通过下边浏览找到目的序列选择数据库： 一般选择NR数据库点击：BLAST接下来进入的页面有

22、如下结果：这张图是数据库信息：这是一张总图：这是一些详细点的信息： 下图是详细的碱基匹配情况：Identities:同源性Gaps 空缺，即缺失碱基Strand 即输入序列与数据库中序列的方向性：Plus : 正向Minus：反向如进行两序列比对：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/bl2seq/wblast2.cgi在下列框中输入需要比对的两个序列，然后点击ALign当然我们需要的最多的可能是猪的数据库：举例如下：在这个网址http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/点击突下红色区域：即进入下面网址：http:/www.ncbi.nlm.n

23、ih.gov/mapview/点击红色区域，乃进入猪数据库下面进入下面的网页：可供选的德数据库:目前咱们实验室最多可能使用的是EST，HTGS，估计后面会用到 RNA，protein数据库。现在目前由于小鼠和人类基因组计划的完成，和研究的深入，许多基因已经完成，但是猪上边好多目前还没有基因全长，下面举一个利用人或小鼠的全长WNT10基因CDS，（即编码蛋白质的，开放阅读框，ORF）在上述BLAST pig Sequences输入小鼠wnt10全长：选择EST数据库点击：进入如下界面：我个人喜欢选择红色的，比较直观，然后点击绿色方框：进而进入如下界面：这是总的信息：这是详细信息: 据资料显示EST（表达序列标签）准确率在97%，即我们可及根据猪的序列设计引物PCR。分子生物学方用试剂配方：