定量PCR中-ct值的含义.doc

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实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。

本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。

一.   实时荧光定量PCR原理

    所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

1.       Ct值的定义

    在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念——Ct值。

C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：

每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。

图1.Ct值的确定

2.       荧光域值（threshold）的设定

PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：

threshold=10´SDcycle6-15

3.       Ct值与起始模板的关系

    研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。

利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（如图2所示）。

因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

图2.荧光定量标准曲线

4.       荧光化学

荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：

荧光探针和荧光染料〔2〕。

现将其原理简述如下：

1）TaqMan荧光探针：

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

如图3所示。

图3.TaqMan荧光探针工作原理

2）SYBR荧光染料：

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

二．内标在传统定量中的意义

1．几种传统定量PCR方法简介〔3〕：

1）内参照法：

在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。

上游引物用荧光标记，下游引物不标记。

在模板扩增的同时，内标也被扩增。

在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板〔4〕。

2）竞争法：

选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。

在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。

扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数〔5〕。

3）PCR－ELISA法：

利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。

常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的〔6〕。

2．内标在传统定量中的作用

    由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。

同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异（见图4），因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。

加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。

但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。

图4.相同模板在同一台PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图

终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性

三．内标对荧光定量PCR的影响

1．实时荧光定量PCR无需内标

  实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。

因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：

1）Ct值的重现性

PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。

（见图4）

2）Ct值与起始模板的线性关系

由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。

2．内标对实时荧光定量PCR的影响

    若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著〔7,8〕。

但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。

也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。

    美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是：

内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方〔9〕。

    AppliedBiosystems公司的7700型实时荧光定量PCR仪是全球公认的荧光定量PCR的金标准，可实现多色荧光同时检测，但定量检测仍然采用外标准曲线的方法，而不用内标进行定量。

  综上所述，利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域〔10,11,12,13〕。

参考文献

1.       HiguchiR,FocklerC,etal.KineticPCRanalysis:

real-timemonitoringofDNAamplificationreactions.Biotechnology,1993,11（9）:

1026-1030.

2.      DNA/RNAReal-TimeQuantitativePCR-Rev.B AppliedBiosystems

3.      定量聚合酶链反应的研究进展与临床应用.中华检验医学杂志2000,23

（2）:

120-121.

4.      AndersonKM,CheungPH,KellMD.RapidgenerationofhomologousinternalstandardsandevaluationofdataforquantitaionofmessengerRNAbycompetitivepolymerasechainreaction.JPharmacolToxicolMethods,1997,38:

133-140.

5.      WuhuA,WaiztuM,KochA.Arapidandsensitiveprotocolforcompetitivereversetranscriprase（CRT）PCRanalysisofcellulargenes.BrainPathol,1998,8:

13-18

6.      仝文斌，高巍，费然等.核酸扩增产物的量化酶免疫通用型检测方法.中华医学检验杂志，1999,22:

83-86.

7.      ActorJK,LimorJR,HunterRL.Aflexiblebioluminescent-quantitivepolymerasereactionassayforanalysisofcompetitivePCRamplicons.JClinLabAnal,1999,13

（1）:

40-47.

8.      SchnellS,MendozaC.Enzymologicalconsiderationsforatheoreticaldescriptionofthequantitativecompetitivepolymerasechainreaction（QC-PCR）.JTheorBiol,1997,184（4）:

433-440.

9.        KeLD,ChenZ,YungWK.Areliabilitytestofstandard-basedquantitativePCR:

exogenousvsendogenousstandards.Mol.CellProbes,2000,14

（2）:

127-135.

10.    BeckerK.,D.PanandC.B.Whitely.Real-timequantitativepolymerasechainreactiontoassessgenetransfer.Hum.GeneTher,1999,10:

2559-2566.

11.    Higgis,J.A.,etal.5’nucleasePCRassaytodetectYersiniapesits.JClinMicrobiol,1998,36:

2284-2288.

12.    BiecheI.,P.Oondy,etal.Real-timereversetranscription-PCRassayforfuturenagementofERBB2-basedclinicalapolications.Clin.Chem,1999,45:

1148-1156.

13.    WangX.X.Li,etal.Applicationofreal-timepolymerasechainreactiontoquantitateinducedexpressionofinterleukin-1betamRNAinischemicbraintolerance.2000,Neurosci.Res,59

（2）:

238-46.

荧光定量PCR中基线、阈值、Ct值、扩增曲线、熔解曲线等基本概念

基线（Baseline）：

是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大。

接近一条直线，这样的直线即是基线。

荧光域值（threshold）的设定：

一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR第3—15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。

CT值：

表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。

反之亦然。

利用已