基因工程作业引物设计讲解.docx
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基因工程作业引物设计讲解
口腔鳞癌组织中肿瘤转移相关基因1（MTA1）
一、选择原因及应用
口腔鳞癌组织中肿瘤转移相关基因1（MTA1）在蛋白和mRNA的表达水平，揭示其与口腔鳞癌（OSCC）发生、发展的关系。
方法采用免疫组织化学法和原位杂交技术检测46例OSCC标本、15例口腔黏膜白斑与20例正常口腔黏膜标本中MTAl基因的表达水平，并分析其与OSCC临床病理学参数的关系。
结果MTA1蛋白和MTA1mRNA在OSCC组织中的表达水平显著高于口腔黏膜白斑和正常口腔黏膜（P〈0．05），口腔黏膜白斑中MTA1蛋白和MTA1mRNA表达水平显著高于口腔正常黏膜（P〈0．01），MTA1蛋白和MTA1mRNA表达与肿瘤浸润深度和淋巴结转移密切相关（P〈0．05）。
结论MTA1基因在蛋白和mRNA的表达水平在OSCC发生、发展及浸润转移过程中起一定促进作用，有望成为判断OSCC预后及选择治疗方案的一个新肿瘤标志物。
2、2查阅NCBI得到MTA1相关信息并获得目的基因
PREDICTED:
Gorillagorillagorillametastasisassociated1（MTA1）,mRNA
NCBIReferenceSequence:
XM_004055801.1
FASTAGraphics
∙Comment
∙Features
∙Sequence
LOCUSXM_0040558012872bpmRNAlinearPRI03-DEC-2012
DEFINITIONPREDICTED:
Gorillagorillagorillametastasisassociated1（MTA1）,
mRNA.
ACCESSIONXM_004055801
VERSIONXM_004055801.1GI:
426378238
KEYWORDS.
SOURCEGorillagorillagorilla（westernlowlandgorilla）
ORGANISMGorillagorillagorilla
Eukaryota;Metazoa;Chordata;Craniata;Vertebrata;Euteleostomi;
Mammalia;Eutheria;Euarchontoglires;Primates;Haplorrhini;
Catarrhini;Hominidae;Gorilla.
COMMENTMODELREFSEQ:
Thisrecordispredictedbyautomatedcomputational
analysis.Thisrecordisderivedfromagenomicsequence
（NW_004005914）annotatedusinggenepredictionmethod:
GNOMON,
supportedbymRNAandESTevidence.
Alsosee:
DocumentationofNCBI'sAnnotationProcess
##Genome-Annotation-Data-START##
AnnotationProvider:
:
NCBI
AnnotationStatus:
:
Fullannotation
AnnotationVersion:
:
GorillagorillaAnnotationRelease100
AnnotationPipeline:
:
NCBIeukaryoticgenomeannotationpipeline
AnnotationMethod:
:
Best-placedRefSeq;Gnomon
FeaturesAnnotated:
:
Gene;mRNA;CDS;ncRNA
##Genome-Annotation-Data-END##
FEATURESLocation/Qualifiers
source1..2872
/organism="Gorillagorillagorilla"
/mol_type="mRNA"
/sub_species="gorilla"
/db_xref="taxon:
9595"
/chromosome="14"
gene1..2872
/gene="MTA1"
/note="Derivedbyautomatedcomputationalanalysisusing
genepredictionmethod:
GNOMON.Supportingevidence
includessimilarityto:
4mRNAs,303ESTs,7Proteins"
/db_xref="GeneID:
101134898"
misc_feature104..106
/gene="MTA1"
/note="upstreamin-framestopcodon"
CDS212..2359
/gene="MTA1"
/codon_start=1
/product="metastasis-associatedproteinMTA1"
/protein_id="XP_004055849.1"
/db_xref="GI:
426378239"
/db_xref="GeneID:
101134898"
/translation="MAANMYRVGDYVYFENSSSNPYLIRRIEELNKTANGNVEAKVVC
FYRRRDISSTLIALADKHATLSVCYKAGPGADNGEEGEIEEEMENPEMVDLPEKLKHQ
LRHRELFLSRQLESLPATHIRGKCSVTLLNETESLKSYLEREDFFFYSLVYDPQQKTL
LADKGEIRVGNRYQADITDLLKEGEEDGRDQSKLETKVWEAHNPLTDKQIDQFLVVAR
SVGTFARALDCSSSVRQPSLHMSAAAASRDITLFHAMDTLHKNIYDISKAISALVPQG
GPVLCRDEMEEWSASEANLFEEALEKYGKDFTDIQQDFLPWKSLTSIIEYYYMWKTTD
RYVQQKRLKAAEAESKLKQVYIPNYNKPNPNQISVNNVKAGVVNGTGAPGQSPGAGRA
CESCYTTQSYQWYSWGPPNMQCRLCASCWTYWKKYGGLKMPTRLDGERPGPNRSNMSP
HGLPARSSGSPKFAMKTRQAFYLHTTKLTRIARRLCREILRPWHAARHPYLPINSAAI
KAECTARLPEASQSPLVLKQAVRKPLEAVLRYLETHPRPPKPDPVKSVSSVLSSLTPA
KVAPVINNGSPTILGKRSYEQHNGVDGNMKKRLLMPSRGLANHGQTRHMGPSRNLLLN
GKSYPTKVRLIRGGSLPPVKRRRMNWIDAPDDVFYMATEETRKIRKLLSSSETKRAAR
RPYKPIALRQSQALPLRPPPPAPVNDEPIVIED"
ORIGIN
1tcctcctcttcctctcccgcccgcgccgcggccctcccgtccctgcgcggcctcggcggc
61ctcggcggcggcggcggcggcggcggcagcagcgcggcccctttaaacgcctgcggcgcc
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//
3、表达载体的选择
我所选用的原核表达载体为质粒pBR322；
pBR322是一种常用的E.coli克隆载体
（1），为4,361bp的环状双链DNA
（2）。
pBR322携带有氨苄青霉素和四环素的抗性基因，且能在氯霉素存在条件下增殖。
四、宿主菌为大肠杆菌。
五、酶切位点
用primer5.0检查编码序列
经检验编码序列中没有EcoRI和HindIII识别位点，所以可用EcoRI和HindIII识别位点
为了使目的基因片段能连接到载体质粒pBR322上，所以在目的片段的5’端和3’端分别连接上HindⅢ识别序列和EcoRI识别序列，如下
5’——G↓AATTCATGGCCGCCAACATGTACA……CATCGTCATCGAGGACTAGA↓AGCTT----3’
3’----CTTAA↑GTACCGGCGGTTGTACATGT……GTAGCAGTAGCTCCTGATCTTCGA↑A----5’
↓↓
EcoRI识别位点HindIII识别位点
六、引物设计
PCR引物设计原理：
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
PCR引物设计原则：
1.引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74?
，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。
2.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。
引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。
3.引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
4.设计的引物中，应含有进一步操作中可利用的限制性内切酶识别序列，若靶DNA一端或两端不含这样的序列，则可根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。
这种情况下，设计引物要长一些。
第一部：
扩增基本序列
5’——ATGGCCGCCAACATGTACA……CATCGTCATCGAGGACTAG----3’
……GTAGCAGTAGCTCCTGATC----5’primer2
3’----TACCGGCGGTTGTACATGT……GTAGCAGTAGCTCCTGATC----5’
5’------ATGGCCGCCAACATGTACA……primer1
第二步：
GC比值和Tm值
Primer15’------ATGGCCGCCAACATGTACA……（GC:
53%Tm=58）
Primer25’----CTAGTCCTCGATGACGATG----（GC:
53%Tm=58）
Primer15’------ATGGCCGCCAACATGTACA（GC:
53%Tm=58）
Primer25’----CTAGTCCTCGATGACGATG（GC:
53%Tm=58）
第三步：
酶切位点
Primer15’------GAATTCATGGCCGCCAACATGTACA
Primer25’----AAGCTTCTAGTCCTCGATGACGATG
第四步：
保护序列
Primer15’------GCGCGAATTCATGGCCGCCAACATGTACA
Primer25’----GCGGAAGCTTCTAGTCCTCGATGACGATG
故得出结论：
1、在上游引物中加入EcoRI酶切位点，且目的基因内不含有此酶切位点，得到引物：
2、在下游引物中加入HindIII酶切位点，且目的基因内不含有此酶切位点，得到引物：
Primer15’------GCGCGAATTCATGGCCGCCAACATGTACA
Primer25’----GCGGAAGCTTCTAGTCCTCGATGACGATG
七、过程
1、PCR体外扩增
反应体系：
模板0.5ul
上游引物1ul
下游引物1ul
10XTaqDNA聚合酶缓冲液2.5ul
dNTP混合物f各2．5mM）2ul
Taq酶1ul
dH2017ul
总量25ul
程序设计
1、94℃预变性2min
2、94℃变性45s
3、58℃退火30s
4、70℃延伸30s
5、重复步骤2—4,30次
6、72℃延伸3min
7、4℃保存
2、分离质粒载体
先用溶菌酶处理含有质粒载体的宿主菌培养物，以除去其细胞壁，然后加入去污剂（例如SDS），使其发生温和的溶菌作用。
这样质粒DNA、多聚核糖体、可溶性蛋白质、tRNA等细胞内的大分子物质便逐步地释放出来，而核染色体的DNA则仍然附着在细胞的残渣碎片上，经过离心处理，可使其同质粒分开。
将离心所得的含有质粒DNA的上清液，加酚处理除去蛋白。
剩下的DNA混合物中，质粒DNA（cccDNA）呈超螺旋状态。
为进一步纯化出cccDNA分子，可在含有溴化乙锭（EB）染料和氯化铯溶液中进行密度梯度离心。
EB是一种扁平分子，它能插入双链DNA分子的两个相邻碱基对之间，从而降低了DNA分子在氯化铯中的密度。
又由于cccDNA同EB的结合能力比开环DNA和线性DNA低得多，这样在氯化绝密度梯度中便可容易地将cccDNA同其他两种类型的DNA分离开来其他载体DNA分高纯化的原理与上述类似。
3、目的基因与载体的连接
外源DNA片段与载体DNA分子的连接，即DNA分子的体外重组，主要依赖于限制性内切核酸酶及DNA连接酶的作用。
4、感受态细胞的制备
首先配制以下试剂：
1）SOB培养基
配制500mlSOB培养基，在450ml水中加入以下试剂：
胰蛋白胨（tryptone）10g
酵母提取物（yeastextract）．2．5g
NaCl0．25g
用电磁搅拌器搅拌使其完全溶解，然后加入250mmol／LKCI溶液5ml，用NaOH调节溶液的pH值至7．0．然后加dH20定容至500ml，高压灭菌．在使用前加入2．5ml经灭菌的2mol/LMgCl2溶液
n配置200mlTBbuffer，加入以下溶液：
nKCl40ml
nMnCl224ml
nCaCl26ml
nK-MESbuffer5ml
ndH20125ml
n总量200ml
n1）大肠杆菌（LB培养基含7％DMSO保种）解冻，接种于LB平皿上，37℃培养箱内培养过夜．
n2）挑取单克隆，转入500mlSOB培养基中，1813，摇床培养18～24h左右，直到OD600值达到0．6为止．
n3）从摇床上取出摇瓶，将菌体转到500mi离心管，冰浴10min．
n4）3500rpm，4℃，冷冻离心，10min，弃上清．
n5）用150ml冰浴过的TBbuffer重悬菌体沉淀，再次冰浴10min，按步骤4条件离心，弃上清．
n6）用40mlTBbuffer和2．8mlDMSO的混合液（DMS0的含量约占7％）再次重悬沉淀．
n7）冰浴10min，混匀，超净台内分装（每管0．5～1．0m1）感受态大肠杆菌，置液氮罐中冷冻保存．用时从液氮罐中取出放在冰上约20min，融化后即可用于转化
5、重组子的筛选
6、目的基因导入受体细胞
7、外源基因的表达
8、用选择培养基判断目的基因是否表达
因为pBR322携带有氨苄青霉素和四环素的抗性基因，且能在氯霉素存在条件下增殖。
所以用含有氨苄青霉素的培养基中培养，若该基因组的表达物，能在该培养基上生长则说明该重组子已经表达了，反之，则没有表达。
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