基因工程作业引物设计讲解.docx
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基因工程作业引物设计讲解
口腔鳞癌组织中肿瘤转移相关基因1(MTA1)
一、选择原因及应用
口腔鳞癌组织中肿瘤转移相关基因1(MTA1)在蛋白和mRNA的表达水平,揭示其与口腔鳞癌(OSCC)发生、发展的关系。
方法采用免疫组织化学法和原位杂交技术检测46例OSCC标本、15例口腔黏膜白斑与20例正常口腔黏膜标本中MTAl基因的表达水平,并分析其与OSCC临床病理学参数的关系。
结果MTA1蛋白和MTA1mRNA在OSCC组织中的表达水平显著高于口腔黏膜白斑和正常口腔黏膜(P〈0.05),口腔黏膜白斑中MTA1蛋白和MTA1mRNA表达水平显著高于口腔正常黏膜(P〈0.01),MTA1蛋白和MTA1mRNA表达与肿瘤浸润深度和淋巴结转移密切相关(P〈0.05)。
结论MTA1基因在蛋白和mRNA的表达水平在OSCC发生、发展及浸润转移过程中起一定促进作用,有望成为判断OSCC预后及选择治疗方案的一个新肿瘤标志物。
2、2查阅NCBI得到MTA1相关信息并获得目的基因
PREDICTED:
Gorillagorillagorillametastasisassociated1(MTA1),mRNA
NCBIReferenceSequence:
XM_004055801.1
FASTAGraphics
∙Comment
∙Features
∙Sequence
LOCUSXM_0040558012872bpmRNAlinearPRI03-DEC-2012
DEFINITIONPREDICTED:
Gorillagorillagorillametastasisassociated1(MTA1),
mRNA.
ACCESSIONXM_004055801
VERSIONXM_004055801.1GI:
426378238
KEYWORDS.
SOURCEGorillagorillagorilla(westernlowlandgorilla)
ORGANISMGorillagorillagorilla
Eukaryota;Metazoa;Chordata;Craniata;Vertebrata;Euteleostomi;
Mammalia;Eutheria;Euarchontoglires;Primates;Haplorrhini;
Catarrhini;Hominidae;Gorilla.
COMMENTMODELREFSEQ:
Thisrecordispredictedbyautomatedcomputational
analysis.Thisrecordisderivedfromagenomicsequence
(NW_004005914)annotatedusinggenepredictionmethod:
GNOMON,
supportedbymRNAandESTevidence.
Alsosee:
DocumentationofNCBI'sAnnotationProcess
##Genome-Annotation-Data-START##
AnnotationProvider:
:
NCBI
AnnotationStatus:
:
Fullannotation
AnnotationVersion:
:
GorillagorillaAnnotationRelease100
AnnotationPipeline:
:
NCBIeukaryoticgenomeannotationpipeline
AnnotationMethod:
:
Best-placedRefSeq;Gnomon
FeaturesAnnotated:
:
Gene;mRNA;CDS;ncRNA
##Genome-Annotation-Data-END##
FEATURESLocation/Qualifiers
source1..2872
/organism="Gorillagorillagorilla"
/mol_type="mRNA"
/sub_species="gorilla"
/db_xref="taxon:
9595"
/chromosome="14"
gene1..2872
/gene="MTA1"
/note="Derivedbyautomatedcomputationalanalysisusing
genepredictionmethod:
GNOMON.Supportingevidence
includessimilarityto:
4mRNAs,303ESTs,7Proteins"
/db_xref="GeneID:
101134898"
misc_feature104..106
/gene="MTA1"
/note="upstreamin-framestopcodon"
CDS212..2359
/gene="MTA1"
/codon_start=1
/product="metastasis-associatedproteinMTA1"
/protein_id="XP_004055849.1"
/db_xref="GI:
426378239"
/db_xref="GeneID:
101134898"
/translation="MAANMYRVGDYVYFENSSSNPYLIRRIEELNKTANGNVEAKVVC
FYRRRDISSTLIALADKHATLSVCYKAGPGADNGEEGEIEEEMENPEMVDLPEKLKHQ
LRHRELFLSRQLESLPATHIRGKCSVTLLNETESLKSYLEREDFFFYSLVYDPQQKTL
LADKGEIRVGNRYQADITDLLKEGEEDGRDQSKLETKVWEAHNPLTDKQIDQFLVVAR
SVGTFARALDCSSSVRQPSLHMSAAAASRDITLFHAMDTLHKNIYDISKAISALVPQG
GPVLCRDEMEEWSASEANLFEEALEKYGKDFTDIQQDFLPWKSLTSIIEYYYMWKTTD
RYVQQKRLKAAEAESKLKQVYIPNYNKPNPNQISVNNVKAGVVNGTGAPGQSPGAGRA
CESCYTTQSYQWYSWGPPNMQCRLCASCWTYWKKYGGLKMPTRLDGERPGPNRSNMSP
HGLPARSSGSPKFAMKTRQAFYLHTTKLTRIARRLCREILRPWHAARHPYLPINSAAI
KAECTARLPEASQSPLVLKQAVRKPLEAVLRYLETHPRPPKPDPVKSVSSVLSSLTPA
KVAPVINNGSPTILGKRSYEQHNGVDGNMKKRLLMPSRGLANHGQTRHMGPSRNLLLN
GKSYPTKVRLIRGGSLPPVKRRRMNWIDAPDDVFYMATEETRKIRKLLSSSETKRAAR
RPYKPIALRQSQALPLRPPPPAPVNDEPIVIED"
ORIGIN
1tcctcctcttcctctcccgcccgcgccgcggccctcccgtccctgcgcggcctcggcggc
61ctcggcggcggcggcggcggcggcggcagcagcgcggcccctttaaacgcctgcggcgcc
121ccccgcccccgccatcgcgcctccattttcccggccgcccgcgccgagcgccgcgcccgc
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//
3、表达载体的选择
我所选用的原核表达载体为质粒pBR322;
pBR322是一种常用的E.coli克隆载体
(1),为4,361bp的环状双链DNA
(2)。
pBR322携带有氨苄青霉素和四环素的抗性基因,且能在氯霉素存在条件下增殖。
四、宿主菌为大肠杆菌。
五、酶切位点
用primer5.0检查编码序列
经检验编码序列中没有EcoRI和HindIII识别位点,所以可用EcoRI和HindIII识别位点
为了使目的基因片段能连接到载体质粒pBR322上,所以在目的片段的5’端和3’端分别连接上HindⅢ识别序列和EcoRI识别序列,如下
5’——G↓AATTCATGGCCGCCAACATGTACA……CATCGTCATCGAGGACTAGA↓AGCTT----3’
3’----CTTAA↑GTACCGGCGGTTGTACATGT……GTAGCAGTAGCTCCTGATCTTCGA↑A----5’
↓↓
EcoRI识别位点HindIII识别位点
六、引物设计
PCR引物设计原理:
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。
PCR引物设计原则:
1.引物的长度一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74?
,不适于TaqDNA聚合酶进行反应。
2.引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错配。
引物3’端出现3个以上的连续碱基,如GGG或CCC,也会使错误引发机率增加。
3.引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
4.设计的引物中,应含有进一步操作中可利用的限制性内切酶识别序列,若靶DNA一端或两端不含这样的序列,则可根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。
这种情况下,设计引物要长一些。
第一部:
扩增基本序列
5’——ATGGCCGCCAACATGTACA……CATCGTCATCGAGGACTAG----3’
……GTAGCAGTAGCTCCTGATC----5’primer2
3’----TACCGGCGGTTGTACATGT……GTAGCAGTAGCTCCTGATC----5’
5’------ATGGCCGCCAACATGTACA……primer1
第二步:
GC比值和Tm值
Primer15’------ATGGCCGCCAACATGTACA……(GC:
53%Tm=58)
Primer25’----CTAGTCCTCGATGACGATG----(GC:
53%Tm=58)
Primer15’------ATGGCCGCCAACATGTACA(GC:
53%Tm=58)
Primer25’----CTAGTCCTCGATGACGATG(GC:
53%Tm=58)
第三步:
酶切位点
Primer15’------GAATTCATGGCCGCCAACATGTACA
Primer25’----AAGCTTCTAGTCCTCGATGACGATG
第四步:
保护序列
Primer15’------GCGCGAATTCATGGCCGCCAACATGTACA
Primer25’----GCGGAAGCTTCTAGTCCTCGATGACGATG
故得出结论:
1、在上游引物中加入EcoRI酶切位点,且目的基因内不含有此酶切位点,得到引物:
2、在下游引物中加入HindIII酶切位点,且目的基因内不含有此酶切位点,得到引物:
Primer15’------GCGCGAATTCATGGCCGCCAACATGTACA
Primer25’----GCGGAAGCTTCTAGTCCTCGATGACGATG
七、过程
1、PCR体外扩增
反应体系:
模板0.5ul
上游引物1ul
下游引物1ul
10XTaqDNA聚合酶缓冲液2.5ul
dNTP混合物f各2.5mM)2ul
Taq酶1ul
dH2017ul
总量25ul
程序设计
1、94℃预变性2min
2、94℃变性45s
3、58℃退火30s
4、70℃延伸30s
5、重复步骤2—4,30次
6、72℃延伸3min
7、4℃保存
2、分离质粒载体
先用溶菌酶处理含有质粒载体的宿主菌培养物,以除去其细胞壁,然后加入去污剂(例如SDS),使其发生温和的溶菌作用。
这样质粒DNA、多聚核糖体、可溶性蛋白质、tRNA等细胞内的大分子物质便逐步地释放出来,而核染色体的DNA则仍然附着在细胞的残渣碎片上,经过离心处理,可使其同质粒分开。
将离心所得的含有质粒DNA的上清液,加酚处理除去蛋白。
剩下的DNA混合物中,质粒DNA(cccDNA)呈超螺旋状态。
为进一步纯化出cccDNA分子,可在含有溴化乙锭(EB)染料和氯化铯溶液中进行密度梯度离心。
EB是一种扁平分子,它能插入双链DNA分子的两个相邻碱基对之间,从而降低了DNA分子在氯化铯中的密度。
又由于cccDNA同EB的结合能力比开环DNA和线性DNA低得多,这样在氯化绝密度梯度中便可容易地将cccDNA同其他两种类型的DNA分离开来其他载体DNA分高纯化的原理与上述类似。
3、目的基因与载体的连接
外源DNA片段与载体DNA分子的连接,即DNA分子的体外重组,主要依赖于限制性内切核酸酶及DNA连接酶的作用。
4、感受态细胞的制备
首先配制以下试剂:
1)SOB培养基
配制500mlSOB培养基,在450ml水中加入以下试剂:
胰蛋白胨(tryptone)10g
酵母提取物(yeastextract).2.5g
NaCl0.25g
用电磁搅拌器搅拌使其完全溶解,然后加入250mmol/LKCI溶液5ml,用NaOH调节溶液的pH值至7.0.然后加dH20定容至500ml,高压灭菌.在使用前加入2.5ml经灭菌的2mol/LMgCl2溶液
n配置200mlTBbuffer,加入以下溶液:
nKCl40ml
nMnCl224ml
nCaCl26ml
nK-MESbuffer5ml
ndH20125ml
n总量200ml
n1)大肠杆菌(LB培养基含7%DMSO保种)解冻,接种于LB平皿上,37℃培养箱内培养过夜.
n2)挑取单克隆,转入500mlSOB培养基中,1813,摇床培养18~24h左右,直到OD600值达到0.6为止.
n3)从摇床上取出摇瓶,将菌体转到500mi离心管,冰浴10min.
n4)3500rpm,4℃,冷冻离心,10min,弃上清.
n5)用150ml冰浴过的TBbuffer重悬菌体沉淀,再次冰浴10min,按步骤4条件离心,弃上清.
n6)用40mlTBbuffer和2.8mlDMSO的混合液(DMS0的含量约占7%)再次重悬沉淀.
n7)冰浴10min,混匀,超净台内分装(每管0.5~1.0m1)感受态大肠杆菌,置液氮罐中冷冻保存.用时从液氮罐中取出放在冰上约20min,融化后即可用于转化
5、重组子的筛选
6、目的基因导入受体细胞
7、外源基因的表达
8、用选择培养基判断目的基因是否表达
因为pBR322携带有氨苄青霉素和四环素的抗性基因,且能在氯霉素存在条件下增殖。
所以用含有氨苄青霉素的培养基中培养,若该基因组的表达物,能在该培养基上生长则说明该重组子已经表达了,反之,则没有表达。