基因工程作业引物设计讲解.docx

1、基因工程作业引物设计讲解口腔鳞癌组织中肿瘤转移相关基因1（MTA1）一、选择原因及应用口腔鳞癌组织中肿瘤转移相关基因1（MTA1）在蛋白和mRNA的表达水平，揭示其与口腔鳞癌（OSCC）发生、发展的关系。方法采用免疫组织化学法和原位杂交技术检测46例OSCC标本、15例口腔黏膜白斑与20例正常口腔黏膜标本中MTAl基因的表达水平，并分析其与OSCC临床病理学参数的关系。结果MTA1蛋白和MTA1mRNA在OSCC组织中的表达水平显著高于口腔黏膜白斑和正常口腔黏膜（P005），口腔黏膜白斑中MTA1蛋白和MTA1mRNA表达水平显著高于口腔正常黏膜（P001），MTA1蛋白和MTA1mRNA表达

2、与肿瘤浸润深度和淋巴结转移密切相关（P005）。结论MTA1基因在蛋白和mRNA的表达水平在OSCC发生、发展及浸润转移过程中起一定促进作用，有望成为判断OSCC预后及选择治疗方案的一个新肿瘤标志物。2、2查阅NCBI得到MTA1相关信息并获得目的基因PREDICTED: Gorilla gorilla gorilla metastasis associated 1 (MTA1), mRNANCBI Reference Sequence: XM_004055801.1FASTA Graphics Comment Features SequenceLOCUS XM_004055801 2872

3、bp mRNA linear PRI 03-DEC-2012DEFINITION PREDICTED: Gorilla gorilla gorilla metastasis associated 1 (MTA1), mRNA.ACCESSION XM_004055801VERSION XM_004055801.1 GI:426378238KEYWORDS .SOURCE Gorilla gorilla gorilla (western lowland gorilla) ORGANISM Gorilla gorilla gorilla Eukaryota; Metazoa; Chordata;

4、Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Primates; Haplorrhini; Catarrhini; Hominidae; Gorilla.COMMENT MODEL REFSEQ: This record is predicted by automated computational analysis. This record is derived from a genomic sequence (NW_004005914) annotated using gene predi

5、ction method: GNOMON, supported by mRNA and EST evidence. Also see: Documentation of NCBIs Annotation Process #Genome-Annotation-Data-START# Annotation Provider : NCBI Annotation Status : Full annotation Annotation Version : Gorilla gorilla Annotation Release 100 Annotation Pipeline : NCBI eukaryoti

6、c genome annotation pipeline Annotation Method : Best-placed RefSeq; Gnomon Features Annotated : Gene; mRNA; CDS; ncRNA #Genome-Annotation-Data-END#FEATURES Location/Qualifiers source 1.2872 /organism=Gorilla gorilla gorilla /mol_type=mRNA /sub_species=gorilla /db_xref=taxon:9595 /chromosome=14 gene

7、 1.2872 /gene=MTA1 /note=Derived by automated computational analysis using gene prediction method: GNOMON. Supporting evidence includes similarity to: 4 mRNAs, 303 ESTs, 7 Proteins /db_xref=GeneID:101134898 misc_feature 104.106 /gene=MTA1 /note=upstream in-frame stop codon CDS 212.2359 /gene=MTA1 /c

8、odon_start=1 /product=metastasis-associated protein MTA1 /protein_id=XP_004055849.1 /db_xref=GI:426378239 /db_xref=GeneID:101134898 /translation=MAANMYRVGDYVYFENSSSNPYLIRRIEELNKTANGNVEAKVVC FYRRRDISSTLIALADKHATLSVCYKAGPGADNGEEGEIEEEMENPEMVDLPEKLKHQ LRHRELFLSRQLESLPATHIRGKCSVTLLNETESLKSYLEREDFFFYSLVY

9、DPQQKTL LADKGEIRVGNRYQADITDLLKEGEEDGRDQSKLETKVWEAHNPLTDKQIDQFLVVAR SVGTFARALDCSSSVRQPSLHMSAAAASRDITLFHAMDTLHKNIYDISKAISALVPQG GPVLCRDEMEEWSASEANLFEEALEKYGKDFTDIQQDFLPWKSLTSIIEYYYMWKTTD RYVQQKRLKAAEAESKLKQVYIPNYNKPNPNQISVNNVKAGVVNGTGAPGQSPGAGRA CESCYTTQSYQWYSWGPPNMQCRLCASCWTYWKKYGGLKMPTRLDGERPGPNRSNM

10、SP HGLPARSSGSPKFAMKTRQAFYLHTTKLTRIARRLCREILRPWHAARHPYLPINSAAI KAECTARLPEASQSPLVLKQAVRKPLEAVLRYLETHPRPPKPDPVKSVSSVLSSLTPA KVAPVINNGSPTILGKRSYEQHNGVDGNMKKRLLMPSRGLANHGQTRHMGPSRNLLLN GKSYPTKVRLIRGGSLPPVKRRRMNWIDAPDDVFYMATEETRKIRKLLSSSETKRAAR RPYKPIALRQSQALPLRPPPPAPVNDEPIVIEDORIGIN 1 tcctcctctt cctctccc

11、gc ccgcgccgcg gccctcccgt ccctgcgcgg cctcggcggc 61 ctcggcggcg gcggcggcgg cggcggcagc agcgcggccc ctttaaacgc ctgcggcgcc 121 ccccgccccc gccatcgcgc ctccattttc ccggccgccc gcgccgagcg ccgcgcccgc 181 cccgggcccc tccgccgccg ccggcccgga catggccgcc aacatgtaca gggtcggaga 241 ctacgtctac tttgagaact cctccagcaa cccatac

12、ctg atccggagga tcgaggagct 301 caacaagacg gccaatggga acgtggaggc caaagtggtg tgcttctacc ggaggcggga 361 catctccagc accctcatcg ccctggccga caagcacgca accctgtcag tctgctataa 421 ggccggaccg ggggcggaca acggcgagga aggggaaata gaagaggaaa tggagaatcc 481 ggaaatggtg gacctgcccg agaaactaaa gcaccagctg cggcatcggg agctg

13、ttcct 541 ctcccggcag ctggagtctc tgcccgccac gcacatcagg ggcaagtgca gcgtcaccct 601 gctcaacgag accgagtcgc tcaagtccta cctggagcgg gaggatttct tcttctattc 661 tctagtctac gacccacagc agaagaccct gctggcagat aaaggagaga ttcgagtagg 721 aaaccggtac caggcagaca tcaccgactt gttaaaagaa ggcgaggagg atggccgaga 781 ccagtccaag

14、 ttggagacca aggtgtggga ggcgcacaac ccactcacag acaagcagat 841 cgaccagttc ctggtggtgg cccgctctgt gggcaccttc gcacgggccc tggactgcag 901 cagctccgtc cgacagccca gcctgcacat gagcgccgca gctgcctccc gagacatcac 961 gctgttccac gccatggata ctctccacaa gaacatctat gacatctcca aggccatctc 1021 ggcactggtg ccgcagggcg ggcccgt

15、gct ctgcagggac gagatggagg agtggtctgc 1081 atcagaggcc aaccttttcg aggaagccct ggaaaaatat gggaaggatt tcacggacat 1141 tcagcaagat tttctcccgt ggaagtcgct gaccagcatc attgagtact actacatgtg 1201 gaagaccacc gacagatacg tgcagcagaa acgcttgaaa gcagctgaag ctgagagcaa 1261 gttaaagcaa gtttatattc ccaactataa caagccaaat c

16、cgaaccaaa tcagtgtcaa 1321 caacgtcaag gccggtgtgg tgaatggcac gggggcgccg ggccagagcc ctggggctgg 1381 ccgggcctgc gagagctgtt acaccacaca gtcttaccag tggtattctt ggggtccccc 1441 taacatgcag tgtcgtctct gcgcatcttg ttggacatat tggaagaaat atggtggctt 1501 gaaaatgcca acccggttag atggagagag gccaggacca aaccgcagta acatga

17、gtcc 1561 ccacggcctc ccagcccgga gcagcgggag ccccaagttt gccatgaaga ccaggcaggc 1621 tttctatctg cacacgacga agctgacgcg gatcgcccgg cgcctgtgcc gtgagatcct 1681 gcgcccgtgg cacgctgcgc ggcaccccta cctgcccatc aacagtgcgg ccatcaaggc 1741 cgagtgcacg gcgcggctgc ccgaagcctc ccagagcccg ctggtgctga agcaggcggt 1801 acgcaa

18、gccg ctggaagccg tgcttcggta tcttgagacc cacccccgtc cccccaagcc 1861 tgaccccgtg aaaagcgtgt ccagcgtgct cagcagcctg acgcccgcca aggtggcccc 1921 cgtcatcaac aacggctccc ccaccatcct gggcaagcgc agctacgagc agcacaacgg 1981 ggtggacggc aacatgaaga agcgcctctt gatgcccagt aggggtctgg caaaccacgg 2041 acagaccagg cacatgggac

19、caagccggaa cctcctgctc aacgggaagt cctaccccac 2101 caaagtgcgc ctgatccggg ggggctccct gcccccagtc aagcggcggc ggatgaactg 2161 gatcgacgcc ccggatgacg tgttctacat ggccacagag gagaccagga agatccgcaa 2221 gctgctctca tcctcggaaa ccaagcgtgc tgcccgccgg ccctacaagc ccatcgccct 2281 gcgccagagc caggccctgc cgctgcggcc accgc

20、cacct gcgcccgtca acgacgagcc 2341 catcgtcatc gaggactagg ggccgccccc acctgcggcc gccccccgcc cctcgcccgc 2401 ccacacggcc ccttcccagc cagcccgccg cccgcccctc agtttggtag tgccccacct 2461 cccgccctca cctgcagaga aacgcgctcc ttggcggaca ctgagggagg agaggaagaa 2521 gcgcggctaa cttattccga gaatgccgag gagttgtcgt ttttagcttt

21、 gtgtttactt 2581 tttggctgga gcggagatga ggggccaccc cgtgcccctg tgctgcgggg ccttttgccc 2641 ggaggccggg ccctaaggtt ttgttgtgtt ctgttgaagg tgccgtttta aattttattt 2701 ttattacttt ttttgtagat gaacttgagc tctgtaactt acacctggaa tgttaggatc 2761 gtgcggccgc ggccggccga gctgcctggc ggggttggcc cttgtctttt caagtaattt 2821

22、 tcatattaaa caaaaacaaa gaaaaaaatc ttataaaaag gaaaaaaacc aa/3、表达载体的选择我所选用的原核表达载体为质粒pBR322；pBR322 是一种常用的 E. coli 克隆载体（1），为 4,361 bp 的环状双链 DNA（2）。pBR322 携带有氨苄青霉素和四环素的抗性基因，且能在氯霉素存在条件下增殖。四、宿主菌为大肠杆菌。五、酶切位点用primer 5.0检查编码序列经检验编码序列中没有EcoRI和HindIII识别位点，所以可用EcoRI和HindIII识别位点 为了使目的基因片段能连接到载体质粒pBR322上，所以在目的片段的5

23、端和3端分别连接上Hind识别序列和EcoRI识别序列，如下5GAATTCATGGCCGCCAACATGTACACATCGTCATCGAGGACTAGAAGCTT-33-CTTAAGTACCGGCGGTTGTACATGTGTAGCAGTAGCTCCTGATCTTCGAA-5 EcoRI识别位点 HindIII识别位点六、引物设计 PCR引物设计原理： PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。 PCR引物设计原则： 1.引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74?，不适于Taq DNA聚

24、合酶进行反应。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 3. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 4. 设计的引物中，应含有进一步操作中可利用的限制性内切酶识别序列，若靶DNA一端或两端不含这样的序列，则可根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。这种情况下，设计引物要长一些。 第一部：扩增基本序列5ATGGCCGCCAACATGTACACATCGTCATCGAGGACTAG -3 GTAGC

25、AGTAGCTCCTGATC -5primer2 3-TACCGGCGGTTGTACATGTGTAGCAGTAGCTCCTGATC -55 -ATGGCCGCCAACATGTACA primer1第二步：GC比值和Tm值Primer1 5 -ATGGCCGCCAACATGTACA(GC:53% Tm=58)Primer2 5-CTAGTCCTCGATGACGATG-(GC:53% Tm=58)Primer1 5 -ATGGCCGCCAACATGTACA (GC:53% Tm=58)Primer2 5-CTAGTCCTCGATGACGATG (GC:53% Tm=58)第三步：酶切位点 Prim

26、er1 5 -GAATTCATGGCCGCCAACATGTACA Primer2 5-AAGCTTCTAGTCCTCGATGACGATG第四步：保护序列Primer1 5 -GCGCGAATTCATGGCCGCCAACATGTACA Primer2 5-GCGGAAGCTTCTAGTCCTCGATGACGATG故得出结论：1、在上游引物中加入EcoRI酶切位点，且目的基因内不含有此酶切位点，得到引物 ：2、在下游引物中加入HindIII酶切位点，且目的基因内不含有此酶切位点，得到引物：Primer1 5 -GCGCGAATTCATGGCCGCCAACATGTACA Primer2 5-GCGG

27、AAGCTTCTAGTCCTCGATGACGATG七、过程1、PCR体外扩增反应体系：模板 0.5ul上游引物 1ul下游引物 1ul10XTaq DNA聚合酶缓冲液 2.5uldNTP混合物f各25mM) 2ulTaq酶 1uldH20 17ul总量 25ul程序设计1、94预变性 2min2、94变性 45s3、58退火 30s4、70延伸 30s5、重复步骤24,30次6、72延伸 3min7、4保存2、 分离质粒载体先用溶菌酶处理含有质粒载体的宿主菌培养物，以除去其细胞壁，然后加入去污剂（例如SDS），使其发生温和的溶菌作用。这样质粒DNA 、多聚核糖体、可溶性蛋白质、tRNA 等细胞

28、内的大分子物质便逐步地释放出来，而核染色体的DNA 则仍然附着在细胞的残渣碎片上，经过离心处理，可使其同质粒分开。将离心所得的含有质粒DNA 的上清液，加酚处理除去蛋白。剩下的DNA 混合物中，质粒DNA （cccDNA ）呈超螺旋状态。为进一步纯化出cccDNA 分子，可在含有溴化乙锭（EB）染料和氯化铯溶液中进行密度梯度离心。EB是一种扁平分子，它能插入双链DNA 分子的两个相邻碱基对之间，从而降低了DNA 分子在氯化铯中的密度。又由于cccDNA 同EB的结合能力比开环DNA 和线性DNA 低得多，这样在氯化绝密度梯度中便可容易地将cccDNA 同其他两种类型的DNA 分离开来其他载体D

29、NA 分高纯化的原理与上述类似。3、 目的基因与载体的连接 外源DNA 片段与载体DNA 分子的连接，即DNA 分子的体外重组，主要依赖于限制性内切核酸酶及DNA连接酶的作用。4、 感受态细胞的制备 首先配制以下试剂：1)SOB培养基配制500ml SOB培养基，在450ml水中加入以下试剂：胰蛋白胨(tryptone) 10g酵母提取物(yeast extract) 25gNaCl 025g用电磁搅拌器搅拌使其完全溶解，然后加入250mmolL KCI溶液5ml，用NaOH调节溶液的pH值至70然后加dH20定容至500ml，高压灭菌在使用前加入25ml经灭菌的2mol/LMgCl2溶液n配

30、置200 ml TB buffer，加入以下溶液：nKCl 40 mlnMnCl2 24mlnCaCl2 6mlnK-MES buffer 5mlndH20 125mln总量 200mln1)大肠杆菌(LB培养基含7DMSO保种)解冻，接种于LB平皿上，37培养箱内培养过夜n2)挑取单克隆，转入500ml SOB培养基中，1813，摇床培养1824h左右，直到OD600值达到06为止n3)从摇床上取出摇瓶，将菌体转到500mi离心管，冰浴10minn4)3500rpm，4，冷冻离心，10min，弃上清n5)用150ml冰浴过的TB buffer重悬菌体沉淀，再次冰浴10min，按步骤4条件离心，弃上清n6)用40mlTBbuffer和28mlDMSO的混合液(DMS0的含量约占7)再次重悬沉淀n7)冰浴10min，混匀，超净台内分装(每管0510m1)感受态大肠杆菌，置液氮罐中冷冻保存用时从液氮罐中取出放在冰上约20min，融化后即可用于转化5、重组子的筛选6、目的基因导入受体细胞7、外源基因的表达8、用选择培养基判断目的基因是否表达因为pBR322 携带有氨苄青霉素和四环素的抗性基因，且能在氯霉素存在条件下增殖。所以用含有氨苄青霉素的培养基中培养，若该基因组的表达物，能在该培养基上生长则说明该重组子已经表达了，反之，则没有表达。