第三章 蛋白质化学.docx
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第三章蛋白质化学
第三章蛋白质化学
蛋白质功能的多样性
●1.催化功能-酶
●2.调控功能-激素、基因调控因子
●3.贮存功能-乳、蛋、谷蛋白
●4.转运功能-膜转运蛋白、血红/血清蛋白
●5.运动功能-鞭毛、肌肉蛋白
●6.结构成分-皮、毛、骨、细胞骨架
●7.支架作用-接头蛋白
●8.防御功能-免疫球蛋白
●9.其他功能
生老病死，万物轮回（蛋白质层次）
●生（诞生、生长）：
在酶催化下老细胞
计划性凋亡和新细胞的再生、活细胞的代谢
----（新陈代谢）
●老？
蛋白质功能普遍衰退
●病？
个别蛋白质的功能障碍
●死？
蛋白质功能的全部停止/分解
蛋白质——生物功能分子
●单细胞生物
多细胞动物
细胞水平
●为什么人体细胞有不同的形状？
细胞内有支撑体
●？
●功能蛋白大多为球状
蛋白质的含氮量
v蛋白氮占生物组织所有含氮物质的绝大部分
v大多数蛋白质含氮量接近于16%
蛋白质含量=每克样品中含氮的克数6.25
v凯氏定氮法
二、蛋白质的水解
●常用盐酸或硫酸
●优点：
水解产物不消旋
●缺点：
Trp被沸酸完全破坏含羟基Ser、Thr、Tyr部分分解
Asn、Gln酰胺基被水解
（二）碱水解
●一般用6MNa（OH）2或4MBa（OH）2
●缺点：
许多AA受到不同程度的破坏
部分水解产物发生消旋化
●优点：
Trp不受破坏
（三）酶水解
●蛋白酶的作用
●优点：
条件温和、常温、常压
无旋光异构、氨基酸不被破坏
●缺点：
水解不完全、中间产物多
蛋白质水解
Ø酸/碱能将蛋白完全水解
得到各种AA的混合物
Ø酶水解一般是部分水解
得到多肽片段和AA的混合物
Ø氨基酸是蛋白质的基本结构单元
什么是α-氨基酸
●----C-C-C-C-COOH
γβα
●----C-C-C-C（NH2）-COOHα-氨基酸
●----C-C-C（NH2）-C-COOHβ-氨基酸
●----C-C（NH2）-C-C-COOHγ-氨基酸
（一）构成蛋白质的氨基酸
●按照酸碱性质分类
1、中性AA
按照侧链基团的不同又分为：
●脂肪族氨基酸
●芳香族氨基酸
●含-OH氨基酸
●含S氨基酸
●亚氨基酸
2、酸性AA
●甘氨酸没有手性
●其余19种AA都具有旋光性
●脯氨酸是α-亚氨基酸
●其余都是α-氨基酸
根据侧链R基的性质分为：
●非极性氨基酸（疏水氨基酸）
●极性氨基酸（亲水氨基酸）
—酸性氨基酸
—碱性氨基酸
—非解离极性氨基酸
根据侧链R基的性质分为：
●脂肪族、芳香族、杂环族氨基酸
必需及非必需氨基酸
可见光区：
无吸收
远紫外和红外区：
都吸收
近紫外区（220—300nm）：
Tyr/Trp/Phe
紫外吸收光谱原因：
-C=C-C=C-C=C-C=C-
●不同pH条件下两性离子的状态发生变化
氨基酸的等电点
●当溶液为某一pH值时，AA主要以兼性离子的形式存在，分子中所含的正负电荷数目正好相等，净电荷为0。
这一pH值即为AA的等电点（pI）。
●在pI时，AA在电场中既不向正极也不向负极移动，即处于两性离子状态。
●H++A-
●K平衡=[H+]*[A-]/[HA]
●pK平衡=pH-lg[A-]/[HA]
●pH=pK平衡+lg[A-]/[HA]
●对于侧链含有可解离基团的AA
●pI取决于两性离子两边pK’值的算术平均值
●酸性AA：
pI=（pK’1+pK’R-COO-）/2
●碱性AA：
pI=（pK’2+pK’R-NH2）/2
三、氨基酸的重要化学反应
（一）由α-氨基参加的反应
1、与亚硝酸反应
2、与甲醛的反应
——生成羟甲氨基衍生物
3、酰化反应
——氨基中的H被酰基取代而酰化
OCOONa在弱碱中
CH2OCCl+H2NCH后酸化
R
OCOOH
CH2OCNCH+Na++Cl-
HR
N-端分析法
特点：
能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。
（1）与NaOH等形成盐
（2）成酯
NH2干燥，HCl
RCHCOOH+C2H5OH
回流
RCHCOOC2H5+H2O
●在pH=5～7的溶液中氨基酸（除Pro和HPro外）和蛋白质都能与茚三酮反应，最终形成蓝紫色化合物
●反应分下面两个步骤进行：
第一步AA被氧化成CO2、NH3和醛
茚三酮被还原成还原型茚三酮。
第二步还原型茚三酮同另一个茚三酮分子
及NH3缩合生成有色物质。
蓝色化合物
●①Pro和Hpro无游离氨基，
只能形成黄色化合物（440nm）
●②可鉴定某化合物是否有可能是AA
●AA-NH2与另一AA–COOH间失水形成的酰胺键称肽键，所形成的化合物称肽。
●由两个AA组成的肽称为二肽
●由多个AA组成的肽则称为多肽
●组成多肽的AA单元称为氨基酸残基
●多肽链中AA残基按一定顺序排列：
氨基酸顺序
●含游离-氨基的一端：
氨基端或N-端
含游离-羧基的一端：
羧基端或C-端
●AA顺序是从N-端开始以C-端氨基酸残基为终点
Ser-Val-Tyr-Asp-Gln
●具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应：
蛋白质在碱性溶液中，能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。
●在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10~120g/L范围内有良好的线性关系
——可用于测定蛋白质的浓度
二、天然存在的重要多肽
●许多分子量较小、以游离状态存在的多肽通常都具有特殊的生理功能，称为活性肽。
如：
脑啡肽、激素类多肽、抗生素类多肽、
谷胱甘肽、蛇毒多肽等
（一）谷胱甘肽（glutathione）
CO----NH-CH-CO--NH-CH2-COOH
（CH2）2CH2
HCNH2SH
COOH还原型谷胱甘肽
●
●Glu------Cys------Gly
S
S
●Glu------Cys------Gly
氧化型谷胱甘肽
●
●L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val
●
●L-OrnL-Orn
●
●L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu
●
●短杆菌肽S（环十肽）
由细菌分泌，含有D-AA和不常见AA，
如鸟氨酸（Ornithine,Orn）
第六节蛋白质的一级结构
在不同肽链中：
氨基酸的数目、种类、排列顺序不同
●氨基酸序列（种类、数目）
——蛋白质的一级结构
●肽链的数目
●端基的组成
●二硫键的位置
二、蛋白质分子内部的作用力
●肽键、二硫键、酯键、配位键
●氢键、疏水作用、范德华力、离子键
（一）肽键
①肽键中C-N键有部分
双键性质
——不能自由旋转
②组成肽键原子处于
同一平面（肽平面）
③键长及键角一定
④以反式结构存在
（二）二硫键（DisulfideBond）
●由含硫氨基酸形成
●起稳定肽链空间结构的作用
●二硫键被破坏，蛋白质生物活性丧失
（三）酯键（EsterBond）
●Ser/Thr的羟基与AA的羧基形成酯键
●磷酸与含羟基AA缩合形成磷酸酯键
（四）盐键/离子键（Electrostaticattraction）
●—具有相反电荷的两个基团间的库仑作用
（五）配位键（Metal-ionCoordination）
●两个原子之间形成的共价键
●共用电子对由其中一个原子提供
●金属离子与蛋白质的结合方式
例如：
铁氧还蛋白
（六）氢键（Hydrogenbond）
●两电负性强的原子对H的静电引力所形成
X—H…Y
●质子给予体X-H和质子接受体Y间相互作用
●氢键具有：
方向性-（键角）指X—H与H…Y间的夹角
饱和性-X—H只与一个Y结合
（七）范德华力
●原子/基团/分子间较弱的、非特异性作用力
极性基团间的取向力
极性基团与非极性基团间的诱导力
非极性基团间的色散力
（八）疏水作用
（HydrophobicInteractions）
●非极性侧链为避开极性溶剂水彼此靠近所产生
●主要存在于蛋白质内部疏水链/腔/缝隙
蛋白质表面通常具有极性链或区域
键能
●肽键
●二硫键
●离子键
●氢键
●疏水键
●范德华力
三、蛋白质一级结构测定
前提：
●1.样品必需纯（>97%以上）
●2.知道蛋白质的分子量
测定的一般步骤
●测定肽链末端数目----由几条肽链组成
●拆分出每一条肽链
●肽链的完全水解测定AA的组成
●肽链的末端分析
●肽链的部分水解（至少2套方案）
●确定二硫键的位置
（1）多肽链的拆分
●几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质
如血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体
●可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链（亚基）
断开二硫键
●在尿素或盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为-SH，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，防止重新被氧化。
●盐酸胍/尿素解离多肽链间的非共价力
●过甲酸氧化法或巯基还原法拆分二硫键
酸水解
●常用6M盐酸或4M硫酸
●优点：
水解产物不消旋
●缺点：
Trp被沸酸完全破坏
含羟基Ser、Thr、Tyr部分分解
Asn、Gln酰胺基被水解
碱水解
●一般用5M氢氧化钠
●缺点：
许多AA受到不同程度的破坏
部分水解产物发生消旋化
●优点：
Trp不受破坏
（3）末端氨基酸残基测定
●Sanger法
●二甲氨基萘磺酰-AA有强荧光，检测灵敏度高
●外切酶:
从多肽链N端逐个向里水解
●最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶
—水解以Leu残基为N-末端肽键速度最大
●肼化物可与苯甲醛缩合成不溶于水的物质
●肽链外切酶:
从多肽链C-端逐个水解
●四种羧肽酶：
A,B,C和Y；
A和B（胰脏）、C（柑桔叶）、Y（面包酵母）
●∽A:
除Pro/Arg/Lys/外所有C-末端AA残基
∽B:
只水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键
①酶解法:
●内切酶：
胰蛋白酶、糜蛋白酶、
胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶
●外切酶：
羧肽酶和氨肽酶
●R1=Lys（K）和Arg（R）
●专一性较强，水解速度快
●AECys（氨乙基Cys）较慢
●R2=Pro（抑制）
②化学裂解法
溴化氰水解法（Cyanogenbromide）
——选择性地切割由Met羧基形成的肽键
（5）肽段的分离纯化
采用两/多种不同的断裂方法断裂多肽
第七节蛋白质的高级结构
蛋白质的一级结构
（Primarystructure）
●组成蛋白质的多肽链数目
●多肽链的氨基酸顺序
●以及多肽链内/间二硫键的数目和位置
——最重要的是多肽链氨基酸顺序
它是蛋白质生物功能的基础
二、构型与构象
构型（configuration）
——几何异构和光学异构
构象（conformation）
——单键的自由旋转产生
区别：
共价键是否断裂
（三）蛋白质的二级结构
酰胺平面与α－碳原子的二面角
多肽链：
通过可旋转的Cα连接的酰胺平面链
●这种旋转是受到限制的
可允许的φ和ψ值：
拉氏构象图
（一）-螺旋
●又称3.613－螺旋
●螺距0.54nm
●每圈含3.6个AA残基
每个AA残基占0.15nm
绕轴旋转100°
●链内形成氢键与轴平行
●多为右手螺旋
●R基大小：
较大的难形成，如多聚Ile
●R基的电荷性质：
不带电荷易形成
●Pro无法形成链内氢键
●由两/多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成
●肽链主链呈锯齿状折叠构象
●平行肽链间以氢键从侧面连接的构象
●C总是处于折叠的角上
●AA的R基团处于折叠的棱角上并与之垂直
●两个AA之间的轴心距为0.35nm
●氢键主要在链间/同一肽链不同部分间形成
●几乎所有肽键都参与链内氢键的交联
●氢键与链的长轴接近垂直
●平行式：
所有肽链的N-端都在同一边
●反平行式：
相邻两条肽链的方向相反
●肽链主链骨架180°的回折结构
特点：
●由4个连续的AA残基组成
●第一个残基C=O
●第四个残基NH
●作用力是氢键
只形成
四、超二级结构与结构域
1、超二级结构
若干相邻的二级结构单元按照一定规律有规则组合在一起、相互作用，形成空间构象上可彼此区别的
二级结构组合单位
2、结构域
二级/超二级结构基础上形成的特定区域
相对独立的、在空间上能辨认的三维实体
由二级结构组合而成
充当三级结构的构件
其间由单肽链连接
免疫球蛋白的结构
立体结构模型
维系力有氢键/疏水键/离子键/范德华力
五、蛋白质的三级结构
由二级结构元件构建成的总三维结构：
●一级结构中相距较远的肽段间的相互关系
●侧链在三维空间中彼此间的相互关系
●例如：
肌红蛋白
肌红蛋白
（QuaternaryStructure）
单
独
亚
基
无
生
物
功
能
第八节 典型蛋白的结构与功能
一、纤维状蛋白质
（一）角蛋白（keratin）
α-角蛋白：
富含胱氨酸
β-角蛋白：
富含Gly、Ala、Ser
卷发（烫发）的生物化学基础
（二）丝心蛋白（fibroin）：
蚕丝和蜘蛛丝
特点：
●反平行式β折叠片
●抗张强度高
●质地柔软
●不能拉伸
丝蛋白的结构
●分子中不含-螺旋
●肽链常由多个六肽单元重复而成
-（Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala）n-
（三）胶原蛋白
Mb的氧结合曲线
MbO2
Hb结合氧的调节
H+、CO2促进O2的释放
第九节蛋白质结构与功能的关系
一、一级结构与功能的关系
（一）种属差异
同源蛋白：
●来自不同生物体、执行同一/相似功能的蛋白
●AA序列具有明显的相似性
序列同源性（sequencehomology）
●不变残基和可变残基
104个AA残基
MW约12.5×103
28个不变残基
进化位置相差愈远，AA序列差别愈大
——用于核对各物种间的分类学关系以及
绘制系统树/进化树
（三）一级结构变异与分子病
血红蛋白分子病
分子病：
由于基因突变，导致蛋白质中氨基酸种类发生变化，并引起功能降低或丧失。
镰刀型贫血症（sickle-cellanemia）
●镰刀状贫血病—血液中大量出现镰刀红细胞，患者因此缺氧窒息
正常型---Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys---
β链谷氨酸
镰刀型---Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys---
β链缬氨酸
（四）蛋白质的激活（参考书上内容）
1、凝血机制
2、酶原的激活
第十节蛋白质的重要性质
一、蛋白质的两性解离和等电点
—与溶剂的性质、离子强度等因素有关
●分子中含自由氨基、羧基、可解离侧链基团
●在某一pH值的溶液中,蛋白质分子上所带的
正、负电荷数量相等，净电荷为零，在电场中
既不移向正极也不移向负极，此时溶液pH值
就是该蛋白质的等电点。
●在等电点时，蛋白质的溶解度最低。
二、蛋白质分子的相对分子质量
1道尔顿＝1×C12绝对质量/12
≈1.66×10-27千克
（一）根据化学组成测定
（二）物理化学法测定
三、蛋白质的胶体性质
五、蛋白质的变性与复性
1、蛋白质变性（denaturation）
某些理化因素破坏天然Pr结构状态，
引起Pr理化性质改变、生物学功能改
变或丧失的现象。
（2）变性因素
物理：
热、紫外线照射、高压和表面张力
化学：
有机溶剂、脲、胍、酸、碱、
重金属阳离子、生物碱等
（3）变性蛋白质的特点
A.生物活性丧失
B.疏水基外露、溶解度降低、粘度增大
C.侧链基团暴露:
——易与化学试剂反应、光学性质变化
D.生化性质改变：
结构伸展易被酶解
2、复性（renaturation）
——除去变性因素后变性蛋白
重新回复到天然结构的现象。
六、蛋白质的紫外吸收与呈色反应
1、紫外吸收
Tyr、Phe、Trp（280nm）
蛋白质浓度=1.55A280-0.76A260
2、呈色反应
（1）双缩脲反应（BiuretReaction）
（2）Millon反应
氮汞试剂与酪氨酸残基反应成红色沉淀
（3）黄色反应
含苯环氨基酸与浓硝酸及氮的颜色反应
生成硝基苯
（4）乙醛酸反应
含有Trp残基的蛋白质溶液加入乙醛酸混匀后,徐徐加入浓硫酸,在两液接触面处呈现紫红色环。
某些氨基酸（蛋白质）的显色反应
第十一节蛋白的分离、纯化与测定
一、分离纯化的方法
（一）根据分子大小不同的分离方法
1、透析和超滤
透析（dialysis）
2、密度梯度离心
一种蛋白质分子在单位离心场的沉降速度
为恒定值，称为：
沉降常数/系数（S）
3、凝胶过滤法测定相对分子质量
（二）利用溶解度差别的分离方法
1、等电点沉淀法
2、盐溶与盐析
3、有机溶剂沉淀
盐溶—盐析
●等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解—盐溶
●原因？
盐析
●向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出
●原因？
（三）根据电荷不同的分离方法
电泳和离子交换法
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法
（四）蛋白质的选择性吸附
——羟基磷灰石
（五）亲和层析
——根据配体特异性的分离
亲和层析法
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