第三章 蛋白质化学.docx

1、第三章 蛋白质化学第三章 蛋白质化学蛋白质功能的多样性 1. 催化功能-酶 2. 调控功能-激素、基因调控因子 3. 贮存功能-乳、蛋、谷蛋白 4. 转运功能-膜转运蛋白、血红/血清蛋白 5. 运动功能-鞭毛、肌肉蛋白 6. 结构成分-皮、毛、骨、细胞骨架 7. 支架作用-接头蛋白 8. 防御功能-免疫球蛋白 9. 其他功能生老病死，万物轮回(蛋白质层次) 生（诞生、生长）：在酶催化下老细胞 计划性凋亡和新细胞的再生、 活细胞的代谢 -（新陈代谢） 老？蛋白质功能普遍衰退 病？个别蛋白质的功能障碍 死？蛋白质功能的全部停止/分解 蛋白质生物功能分子 单细胞生物多细胞动物细胞水平 为什么人体细胞

2、有不同的形状？ 细胞内有支撑体 ？ 功能 蛋 白大多为 球 状蛋白质的含氮量v 蛋白氮占生物组织所有含氮物质的绝大部分v 大多数蛋白质含氮量接近于16% 蛋白质含量 = 每克样品中含氮的克数6.25v 凯氏定氮法二、蛋白质的水解 常用盐酸或硫酸 优点：水解产物不消旋 缺点：Trp被沸酸完全破坏含羟基Ser、Thr、Tyr部分分解 Asn、Gln酰胺基被水解（二）碱水解 一般用6M Na(OH)2或4M Ba(OH)2 缺点：许多AA受到不同程度的破坏 部分水解产物发生消旋化 优点：Trp不受破坏（三）酶水解 蛋白酶的作用 优点：条件温和、常温、常压 无旋光异构、氨基酸不被破坏 缺点：水解不完全

3、、中间产物多蛋白质水解 酸/碱能将蛋白完全水解 得到各种AA的混合物 酶水解一般是部分水解 得到多肽片段和AA的混合物 氨基酸是蛋白质的基本结构单元什么是-氨基酸 -C-C-C-C-COOH -C-C-C-C(NH2)-COOH -氨基酸 -C-C-C(NH2)-C-COOH -氨基酸 -C-C(NH2)-C-C-COOH -氨基酸（一）构成蛋白质的氨基酸 按照酸碱性质分类1、中性AA按照侧链基团的不同又分为： 脂肪族氨基酸 芳香族氨基酸 含-OH氨基酸 含S氨基酸 亚氨基酸2、酸性AA 甘氨酸没有手性 其余19种AA都具有旋光性 脯氨酸是-亚氨基酸 其余都是-氨基酸根据侧链R基的性质分为：

4、非极性氨基酸（疏水氨基酸） 极性氨基酸（亲水氨基酸） 酸性氨基酸 碱性氨基酸 非解离极性氨基酸根据侧链R基的性质分为： 脂肪族、芳香族、杂环族氨基酸必需及非必需氨基酸可见光区：无吸收远紫外和红外区：都吸收近紫外区（220300nm）：Tyr/Trp/Phe紫外吸收光谱原因： -C=C-C=C-C=C-C=C- 不同pH条件下两性离子的状态发生变化氨基酸的等电点 当溶液为某一pH值时，AA主要以兼性离子的形式存在，分子中所含的正负电荷数目正好相等，净电荷为0。这一pH值即为AA的等电点（pI）。 在pI时，AA在电场中既不向正极也不向负极移动，即处于两性离子状态。 H+ + A- K平衡= H+

5、*A-/HA pK平衡= pH - lg A- / HA pH = pK平衡 + lg A- / HA 对于侧链含有可解离基团的AA pI取决于两性离子两边pK值的算术平均值 酸性AA：pI = (pK1 + pKR-COO- )/2 碱性AA：pI = (pK2 + pKR-NH2 )/2 三、 氨基酸的重要化学反应（一）由-氨基参加的反应 1、与亚硝酸反应2、与甲醛的反应 生成羟甲氨基衍生物3、酰化反应 氨基中的H被酰基取代而酰化 O COONa 在弱碱中 CH2 O C Cl + H2N CH 后酸化 R O COOH CH2 O C N CH +Na+Cl- H RN-端分析法特点：能

6、够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。（1）与NaOH等形成盐（2）成酯 NH2 干燥，HCl R CH COOH + C2H5OH 回流 R CH COOC2H5 + H2O 在pH=57的溶液中氨基酸（除Pro和HPro外）和蛋白质都能与茚三酮反应，最终形成蓝紫色化合物 反应分下面两个步骤进行： 第一步 AA被氧化成CO2、NH3和醛 茚三酮被还原成还原型茚三酮。第二步 还原型茚三酮同另一个茚三酮分子及NH3缩合生成有色物质。蓝色化合物 Pro和Hpro无游离氨基， 只能形成黄色化合物（440nm） 可鉴定某化合物是否有可能是AA AA-NH2与另一AA COOH 间失

7、水形成的酰胺键称肽键，所形成的化合物称肽。 由两个AA组成的肽称为二肽 由多个AA组成的肽则称为多肽 组成多肽的AA单元称为氨基酸残基 多肽链中AA残基按一定顺序排列：氨基酸顺序 含游离-氨基的一端：氨基端或N-端 含游离-羧基的一端：羧基端或C-端 AA顺序是从N-端开始以C-端氨基酸残基为终点 Ser-Val-Tyr-Asp-Gln 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应：蛋白质在碱性溶液中，能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。 在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10120 g/L范围内有良好的线性关系 可用于测定蛋白质的浓度二、 天然存在的重要多肽 许多分

8、子量较小、以游离状态存在的多肽通常都具有特殊的生理功能，称为活性肽。如：脑啡肽、激素类多肽、抗生素类多肽、 谷胱甘肽、蛇毒多肽等(一)谷胱甘肽（glutathione） CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOH （CH2）2 CH2 HCNH2 SH COOH 还原型谷胱甘肽 Glu-Cys-Gly S S Glu-Cys-Gly 氧化型谷胱甘肽 L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val L-Orn L-Orn L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu 短杆菌肽S(环十肽) 由细菌分泌，含有D-AA和不常见AA， 如鸟氨酸（Ornithine, Orn） 第六节 蛋白质的一级

9、结构在不同肽链中：氨基酸的数目、种类、排列顺序不同 氨基酸序列(种类、数目) 蛋白质的一级结构 肽链的数目 端基的组成 二硫键的位置二、蛋白质分子内部的作用力 肽键、二硫键、酯键、配位键 氢键、疏水作用、范德华力、离子键（一）肽键肽键中C-N键有部分 双键性质 不能自由旋转组成肽键原子处于 同一平面（肽平面）键长及键角一定以反式 结构存在（二）二硫键 (Disulfide Bond) 由含硫氨基酸形成 起稳定肽链空间结构的作用 二硫键被破坏，蛋白质生物活性丧失（三）酯键 (Ester Bond) Ser/Thr的羟基与AA的羧基形成酯键 磷酸与含羟基AA缩合形成磷酸酯键（四）盐键/离子键 (

10、Electrostatic attraction ) 具有相反电荷的两个基团间的库仑作用（五）配位键(Metal-ion Coordination) 两个原子之间形成的共价键 共用电子对由其中一个原子提供 金属离子与蛋白质的结合方式 例如：铁氧还蛋白（六）氢键( Hydrogen bond ) 两电负性强的原子对H的静电引力所形成 XHY 质子给予体X-H和质子接受体Y间相互作用 氢键具有： 方向性-（键角）指XH与HY间的夹角 饱和性- XH只与一个Y结合（七）范德华力 原子/基团/分子间较弱的、非特异性作用力 极性基团间的取向力 极性基团与非极性基团间的诱导力 非极性基团间的色散力（八）疏

11、水作用 ( Hydrophobic Interactions) 非极性侧链为避开极性溶剂水彼此靠近所产生 主要存在于蛋白质内部疏水链/腔/缝隙 蛋白质表面通常具有极性链或区域 键 能 肽键 二硫键 离子键 氢键 疏水键 范德华力 三、蛋白质一级结构测定前提： 1.样品必需纯（97%以上） 2.知道蛋白质的分子量测定的一般步骤 测定肽链末端数目-由几条肽链组成 拆分出每一条肽链 肽链的完全水解测定AA的组成 肽链的末端分析 肽链的部分水解(至少2套方案) 确定二硫键的位置（1）多肽链的拆分 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质 如血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体 可用8mol/L尿

12、素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)断开二硫键 在尿素或盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为-SH，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，防止重新被氧化。 盐酸胍/尿素解离多肽链间的非共价力 过甲酸氧化法或巯基还原法拆分二硫键酸水解 常用6M盐酸或4M硫酸 优点：水解产物不消旋 缺点：Trp被沸酸完全破坏 含羟基Ser、Thr、Tyr部分分解 Asn、Gln酰胺基被水解碱水解 一般用5M氢氧化钠 缺点：许多AA受到不同程度的破坏 部分水解产物发生消旋化 优点：Trp不受破坏(3)末端氨基酸残基测定 Sanger法 二甲氨基萘磺酰-AA有强荧光，检测灵敏度高 外切酶:从多

13、肽链N端逐个向里水解 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶水解以Leu残基为N-末端肽键速度最大 肼化物可与苯甲醛缩合成不溶于水的物质 肽链外切酶:从多肽链C-端逐个水解 四种羧肽酶：A,B,C和Y； A和B(胰脏)、C(柑桔叶)、Y(面包酵母) A:除Pro/Arg/Lys/外所有C-末端AA残基 B:只水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键 酶解法: 内切酶：胰蛋白酶、糜蛋白酶、 胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶 外切酶：羧肽酶和氨肽酶 R1=Lys（K）和Arg（R） 专一性较强，水解速度快 AECys （氨乙基Cys）较慢 R2=Pro（抑制）化学裂解法 溴化氰水解法(Cyanogen bromide)

14、选择性地切割由Met羧基形成的肽键(5) 肽段的分离纯化 采用两/多种不同的断裂方法断裂多肽第七节 蛋白质的高级结构蛋白质的一级结构(Primary structure) 组成蛋白质的多肽链数目 多肽链的氨基酸顺序 以及多肽链内/间二硫键的数目和位置最重要的是多肽链氨基酸顺序 它是蛋白质生物功能的基础二、构型与构象 构型(configuration) 几何异构和光学异构 构象(conformation) 单键的自由旋转产生 区别：共价键是否断裂（三）蛋白质的二级结构酰胺平面与碳原子的二面角多肽链：通过可旋转的C连接的酰胺平面链 这种旋转是受到限制的可允许的和值： 拉氏构象图 （一）-螺旋 又称

15、3.613螺旋 螺距0.54nm 每圈含3.6个AA残基 每个AA残基占0.15nm 绕轴旋转100 链内形成氢键与轴平行 多为右手螺旋 R基大小：较大的难形成，如多聚Ile R基的电荷性质：不带电荷易形成 Pro无法形成链内氢键 由两/多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成 肽链主链呈锯齿状折叠构象 平行肽链间以氢键从侧面连接的构象 C 总是处于折叠的角上 AA的R基团处于折叠的棱角上并与之垂直 两个AA之间的轴心距为0.35nm 氢键主要在链间/同一肽链不同部分间形成 几乎所有肽键都参与链内氢键的交联 氢键与链的长轴接近垂直 平行式：所有肽链的N-端都在同一边 反平行式：

16、相邻两条肽链的方向相反 肽链主链骨架180的回折结构特点： 由4个连续的AA残基组成 第一个残基C=O 第四个残基NH 作用力是氢键只形成四、超二级结构与结构域1、超二级结构 若干相邻的二级结构单元按照一定规律有规则组合在一起、相互作用，形成空间构象上可彼此区别的 二级结构组合单位2、结构域二级/超二级结构基础上形成的特定区域相对独立的、在空间上能辨认的三维实体由二级结构组合而成充当三级结构的构件其间由单肽链连接免疫球蛋白的结构立体结构模型维系力有氢键/疏水键/离子键/范德华力五、蛋白质的三级结构由二级结构元件构建成的总三维结构： 一级结构中相距较远的肽段间的相互关系 侧链在三维空间中彼此间的

17、相互关系 例如：肌红蛋白肌红蛋白(Quaternary Structure）单独亚基无生物功能第八节典型蛋白的结构与功能一、纤维状蛋白质（一） 角蛋白（keratin） - 角蛋白：富含胱氨酸 - 角蛋白：富含Gly、Ala、Ser卷发(烫发)的生物化学基础（二）丝心蛋白(fibroin)：蚕丝和蜘蛛丝 特点： 反平行式折叠片 抗张强度高 质地柔软 不能拉伸丝蛋白的结构 分子中不含-螺旋 肽链常由多个六肽单元重复而成 -（Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala）n -（三）胶原蛋白Mb的氧结合曲线 MbO2Hb结合氧的调节H+、CO2促进O2的释放第九节 蛋白质结构与功能的关系一、一级

18、结构与功能的关系(一) 种属差异同源蛋白： 来自不同生物体、执行同一 /相似功能的蛋白 AA序列具有明显的相似性序列同源性（sequence homology） 不变残基和可变残基 104 个AA残基 MW约12.5103 2 8个不变残基 进化位置相差愈远，AA序列差别愈大 用于核对各物种间的分类学关系以及 绘制系统树/进化树(三)一级结构变异与分子病 血红蛋白分子病分子病：由于基因突变，导致蛋白质中氨基酸种类发生变化，并引起功能降低或丧失。镰刀型贫血症（sickle-cell anemia） 镰刀状贫血病血液中大量出现镰刀红细胞，患者因此缺氧窒息正常型 -Val-His-Leu-Thr-P

19、ro-Glu-Lys -链 谷氨酸镰刀型 -Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys -链 缬氨酸(四)蛋白质的激活（参考书上内容）1、凝血机制2、酶原的激活第十节 蛋白质的重要性质一、蛋白质的两性解离和等电点 与溶剂的性质、离子强度等因素有关 分子中含自由氨基、羧基、可解离侧链基团 在某一pH值的溶液中,蛋白质分子上所带的 正、负电荷数量相等，净电荷为零，在电场中 既不移向正极也不移向负极，此时溶液pH值 就是该蛋白质的等电点。 在等电点时，蛋白质的溶解度最低。 二、蛋白质分子的相对分子质量 1道尔顿1C12绝对质量/12 1.6610-27千克（一）根据化学组成测定（二）物理

20、化学法测定三、蛋白质的胶体性质五、蛋白质的变性与复性1、蛋白质变性(denaturation) 某些理化因素破坏天然Pr结构状态， 引起Pr理化性质改变、生物学功能改 变或丧失的现象 。（2）变性因素物理：热、紫外线照射、高压和表面张力化学：有机溶剂、脲、胍、 酸、碱、 重金属阳离子、生物碱等（3）变性蛋白质的特点 A.生物活性丧失 B.疏水基外露、溶解度降低、粘度增大 C.侧链基团暴露: 易与化学试剂反应、光学性质变化 D.生化性质改变：结构伸展易被酶解 2、复性（renaturation） 除去变性因素后变性蛋白 重新回复到天然结构的现象。六、蛋白质的紫外吸收与呈色反应1、紫外吸收 Tyr

21、、Phe、Trp（280nm） 蛋白质浓度=1.55A280-0.76A2602、呈色反应（1）双缩脲反应(Biuret Reaction) （2）Millon反应 氮汞试剂与酪氨酸残基反应成红色沉淀（3）黄色反应 含苯环氨基酸与浓硝酸及氮的颜色反应 生成硝基苯 （4）乙醛酸反应 含有Trp残基的蛋白质溶液加入乙醛酸混匀后,徐徐加入浓硫酸,在两液接触面处呈现紫红色环。 某些氨基酸（蛋白质）的显色反应第十一节 蛋白的分离、纯化与测定一、分离纯化的方法（一）根据分子大小不同的分离方法 1、透析和超滤透析（dialysis）2、密度梯度离心一种蛋白质分子在单位离心场的沉降速度为恒定值，称为：沉降常数/系数（S）3、凝胶过滤法测定相对分子质量（二）利用溶解度差别的分离方法1、等电点沉淀法2、盐溶与盐析3、有机溶剂沉淀盐溶盐析 等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解盐溶 原因？盐析 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出 原因？（三）根据电荷不同的分离方法 电泳和离子交换法SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法 （四）蛋白质的选择性吸附 羟基磷灰石（五）亲和层析 根据配体特异性的分离亲和层析法