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马铃薯多酚氧化酶性质研究

摘要

多酚氧化酶是植物中常见的生物催化剂，常催化植物中的各种生物化学反响。

假设以马铃薯为原料提取多酚氧化酶进展别离纯化等研究那么需要使用乙醇作为提取剂。

通过研究得到马铃薯多酚氧化酶的理化性质，酶作用的最适温度和pH分别是40℃和pH5.8。

为了了解低浓度下的亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、偏重亚硫酸氢钠、抗坏血酸、半胱氨酸以与谷胱甘肽等试剂对马铃薯多酚氧化酶的影响，将上述试剂按一定浓度参加马铃薯多酚氧化酶中进展试验，结果说明这些试剂都对多酚氧化酶有一定的抑制作用。

关键词:

马铃薯多酚氧化酶抑制作用

StudyonthefeatureofthePotatosPolyphenolOxidase

LiBozhi

〔CollegeofLifeSciences,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,510642,China〕

Abstract:

Polyphenoloxidaseisacommonbiologicalcatalystinplants.AlwaystakepartinmanycatalyticreactionofplantsBiochemicalreaction.

Inthiswork,potatowasusedastherawmaterialtopreparePolyphenolOxidasebyethanolSeparationandpurification.TostudiedthephysicalandchemicalpropertiesofPotatosPolyphenolOxidase.WeLearntthatthebesttemperatureandPHforthisenzymeis40℃andpH5.8。

InordertoknowCys,Glutathione,Vc,SodiumBisulfite,SodiumsulfiteandSodiumsulfitethesereagent’sactionforthePotatosPolyphenolOxidase.WeaddthesereagentsatacertainconcentrationinPotatosPolyphenolOxidase.Theresultsshowedthatthesereagentshadacertaininhibitoryeffectonpolyphenoloxidase.

Keywords:

PhtatoPolyphenolOxidaseinhibition

1前言

1.1多酚氧化酶研究情况

多酚氧化酶（PolyphenolOxidase简称PPO）是一类广泛分布于植物体中的一种铜结合酶。

它是由核基因编码、多基因控制,在细胞质中合成,通过一定的方式转运至质体而成为具酶活性的形式,对农产品品质形成有重要影响〔代丽等，2007〕。

PPO是由核基因编码，多个基因控制，表现出多基因的家族性。

在番茄中有7个编码PPO的核基因（PPOA、A′、B、C、D、E、F）；在马铃薯中，编码PPO的核基因至少有6个，分别为POT32、POT33、POT41、PT72、NOR333、P1、P2；蚕豆、苹果中至少有四个基因编码PPO；对小麦的PPO进展QTLs定位分析说明，小麦的PPO至少由3个不同的基因编码，控制PPO活性的主效基因位于2D染色体上，2A、2B、3B、3D和6B染色体上有一些微效基因等等〔代丽,等2007〕。

具有导肽进入叶绿体的蛋白是要通过翻译后加工，初始合成的前体要比成熟的蛋白长，导肽是负责细胞器外膜的初始识别，对细胞器蛋白的定位有重要意义。

现有研究也证明PPO分子由无活性转变为有活性的过程中需要经历肽链加工。

〔代丽,等2007〕。

具有保守序列对植物PPO基因的研究过程中无一例外的发现：

所研究的植物均含有保守序列-编码铜结合部位的功能区域〔代丽,等2007〕。

不存在含子长期以来对植物PPO基因的研究，认为PPO基因是无含子的，如马铃薯、葡萄、杏、番茄等，然而Paul等在研究香蕉时，在香蕉果肉中找到一个含85bp含子的PPO基因，其含子富含AT（85%），并有保守的5'供体（donor）和3'受体（acceptor）的剪切位点，符合含子5′GT...AG3'原那么。

〔代丽,等2007〕。

多酚氧化酶结的定位

为了弄清多酚氧化酶的生理功能,必须首先考虑它的细胞和组织定位.不同组织具有不同的功能,而这些组织的功能是靠构成组织的细胞共同完成的,细胞的功能又是由细胞各种各样的细胞器与众多酶类共同作用来实现.〔黄明，等1998〕

对多酚氧化酶的细胞定位研究（包括分级别离研究、细胞化学研究和免疫细胞化学研究等）说明多酚氧化酶是一种质体酶,缺乏质体的组织就不存在多酚氧化酶,例如筛管和筛胞等.但是,有些具有质体的组织细胞也可能没有多酚氧化酶活性,例如在C4植物叶中,只在叶肉组中探测到多酚氧化酶活性,维管束鞘细胞尽管含有丰富叶绿体,却检测不到多酚氧化酶活性.总之,多酚氧化酶存在于含有质体的植物组织,而含有质体的植物组织不一定都存在多酚氧化酶.〔黄明，等1998〕

多酚氧化酶在酚类物质中的作用

新鲜果蔬在加工贮藏等过程中会发生的酶促褐变,主要就是由于果蔬中所含有的多酚氧化酶的作用。

在高等植物体中绝大多数情况是这样：

多酚氧化酶定位于叶绿体的类囊体和其它质体的基质中，而它的酚类底物在液泡中，因此正常组织中的正常情况下它们是空间隔离的，当植物组织受损，这种空间隔离被打破，多酚氧化酶与底物接触，发生作用，羟化单酚为双酚，二酚酶活性氧化双酚为醌，醌自发集合且和细胞蛋白质的一些氨基酸基团发生反响，产生黑色和褐色物质，从而导致组织酶促褐变。

加工过程中因物理损伤等原因而导致这种情况是很普遍的。

不仅如此，果蔬贮藏时因为失水、低温等原因，运输时因为碰撞等原因，都会使果皮等细胞中的空间隔离被打破，在氧的参与下就会发生褐变。

例如马铃薯的黑斑损伤产生就是因为在收获或处理中导致生理紊乱，由多酚氧化酶氧化自身的酚类底物所致。

褐变不但会降低产品的感官、味道，而且因为醌类物质会与蛋白质的一些侧链基团（如-SH，-NH2）结合使蛋白质的结构，营养特征发生改变而降低营养价值〔王浩，等2006〕。

酶促褐变需要三个条件，它们是酶、底物和受氢体氧。

控制三个条件中的任意一个因素或几个因素便能够到达控制果蔬酶促褐变发生的目的。

在加工等生产实践中，底物和氧一般不容易除去。

在这种情况下抑制导致酶促褐变的多酚氧化酶的活性成为加工过程中控制酶促褐变的极其重要的方法〔王浩，等2006〕。

1.2马铃薯以与产业概况

马铃薯是一种重要的高产经济作物，全世界有2/3以上的国家都种植马铃薯，产量达30亿吨左右，是仅次于小麦、玉米、水稻而居第四位的粮食作物。

马铃薯营养丰富，素有“地下苹果〞和“第二面包〞之称，早已为许多国家和人民所重视。

美国农业部研究中心的341号研究报告指出:

“作为食品，全脂奶粉和马铃薯两样便可以提供人体所需的一切营养素〞，并且认为马铃薯将是世界粮食市场的一种主要食品。

我国是世界马铃薯主产国之一。

常年种植面积约409万hm2,产量约600.45亿吨,居世界首位。

但是马铃薯的加工利用却相当落后，马铃薯贮藏过程中，由于腐烂、发芽引起的损失占原料的30%。

由多酚氧化酶引起的酶促褐变以与美拉德反响引起的非酶褐变损害了产品的感官性质，产生变色、变味等不良影响〔芳,等2002〕。

因此，对于马铃薯以与其他果蔬，研究防止褐变是非常重要的。

在马铃薯中导致褐变的关键酶就是多酚氧化酶。

1.3马铃薯多酚氧化酶的研究意义与研究容

多酚氧化酶与果蔬褐变，黑色素生成等有密切的关系，故研究多酚氧化酶具有广泛的意义和实际应用价值。

例如，多酚氧化酶与黑色素合成有关，研究它对于化装品开放很有帮助。

在保鲜技术研究方面，研究多酚氧化酶意义重大。

马铃薯在贮藏和加工的过程中发生的褐变现象是一个急需解决的大问题。

褐变造成的感官，营养等降低，使得产品滞销，造成大量经济损失〔丽香，2015〕。

本论文从提取纯化多酚氧化酶出发，在研究多酚氧化酶根本性质的根底上，对一些物质进展抑制剂研究。

对马铃薯等果蔬的保鲜具有指导意义。

2多酚氧化酶的提取纯化

2.1试剂与仪器

实验材料与试剂：

无水乙醇，考马斯亮蓝G-250，邻苯二酚，十二水合磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，3，5-二硝基水酸，葡萄糖，氢氧化钠，盐酸，酒石酸钾，重蒸酚，亚硫酸钠，牛血清蛋白，磷酸，丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，甘氨酸，琼脂，三羟甲基氨基甲烷，十二烷基硫酸钠，巯基乙醇，溴酚兰，甘油，甲醇，冰乙酸，醋酸钠，对苯二胺，蒸馏水。

本论文使用的马铃薯由当地市场〔华南农业大学〕购得。

试验用仪器：

可见分光光度计，恒温水浴锅，电子天平，冷冻离心机

2.2方法

马铃薯多酚氧化酶提取与纯化

该方法使用了巫进江同学的方法以马铃薯作为提酶原料，经过一系列方法可以制得局部纯化的多酚氧化酶，具体步骤如下：

〔1〕对马铃薯以与pH6.5磷酸缓冲溶液进展预冷,将其放入4℃冰箱里预冷。

〔2〕取出马铃薯，洗净以后去皮，取10g马铃薯切块并参加20mL4℃pH6.5磷酸缓冲溶液冰浴研磨，得到研磨液。

〔3〕在4℃，10000rpm条件下，对研磨液进展高速冷冻离心处理10分钟，去除沉淀，取上清液，此上清液为粗酶液。

〔4〕取10mL粗酶液参加2.5mL无水乙醇，混匀，此时混合液的乙醇浓度为20%，共做6管。

〔5〕将上述6管混合溶液放入4℃冰箱里预冷30分钟。

〔6〕在4℃，10000rpm条件下，对混合溶液进展高速冷冻离心处理10分钟，取出上清液，标记为上清液Ⅰ，保存沉淀物，并用5mLpH6.5磷酸缓冲溶液溶解，标记为沉淀物Ⅰ。

〔7〕取10mL上清液Ⅰ参加3.3mL无水乙醇，混匀，此时混合液的乙醇浓度为40%，共做6管。

〔8〕将上述6管混合溶液放入4℃冰箱里预冷30分钟。

〔9〕在4℃，10000rpm条件下，对混合溶液进展高速冷冻离心处理10分钟，取出上清液，标记为上清液Ⅱ，保存沉淀物，并用5mLpH6.5磷酸缓冲溶液溶解，标记为沉淀物Ⅱ。

经过以上步骤得到的各级纯化物将用于后续的各种测定。

酶活性测定

参考洪等人的方法〔洪,黄建韶，2002〕℃条件下，测定波长为420nm的光密度值〔OD420〕随时间增长直线，从酶液参加后计时，每20S记录一次OD随时间的变化值，以最初直线段的斜率计算酶活力。

酶活力单位〔U〕定义为在测定条件下，每分钟引起分光度改变0.01所需酶量。

3结果

3.1马铃薯多酚氧化酶的纯化研究

目前，在别离提纯马铃薯多酚氧化酶的研究上，大多数研究者选择使用丙酮法来提取多酚氧化酶。

但丙酮对人体具有肝毒性，对于黏膜有一定的刺激性，吸入其蒸气后可引起头痛，支气管炎等病症。

如果大量吸入，还可能失去知觉〔XX百科〕。

乙醇，提纯机理与丙酮相似与丙酮相比，乙醇毒害性更低，在工业生产中更为平安。

本论文探索乙醇提纯多酚氧化酶可行性与效率，为工业使用乙醇提取多酚氧化酶提供资料。

3.1.1低浓度下亚硫酸氢钠对多酚氧化酶催化反响的影响

按照稀释比例参加不同体积的0.1mol/L亚硫酸氢钠溶液，获得不同终浓度，按照酶活力测定方法测定酶活力。

酶活力百分比为反响后酶活力和原酶液酶活力的比值以下为实验结果：

表1：

低浓度下亚硫酸氢钠对多酚氧化酶催化反响的影响

实验组酶活

0.5mmol/L

1mmol/L

2mmol/L

3mmol/L

4mmol/L

组一

10.5

13.5

组二

10.5

13.5

10.5

组三

10.5

13.5

表2：

亚硫酸氢钠在不同低浓度下的各组数据的均值与标准差

0.5mmol/L

1mmol/L

2mmol/L

3mmol/L

4mmol/L

均值

10.5

12.5

标准差

1.2

0.7

1.41

0.7

酶活性百分比〔%〕

终浓度〔mmol/L〕

图1低浓度下亚硫酸氢钠对多酚氧化酶催化反响影响图

3.1.2亚硫酸钠对多酚氧化酶催化反响的影响：

按照稀释比例参加不同体积的0.1mol/L亚硫酸钠溶液，获得不同终浓度，按照酶活力测定方法测定酶活力。

酶活力百分比为反响后酶活力和原酶液酶活力的比值以下为实验结果：

表3低浓度下亚硫酸钠对多酚氧化酶催化反响的影响

实验组酶活

0.5mmol/L

1mmol/L

2mmol/L

3mmol/L

4mmol/L

组一

10.5

组二

10.5

组三

10.5

表4：

亚硫酸钠在不同低浓度下的各组数据的均值与标准差

0.5mmol/L

1mmol/L

2mmol/L

3mmol/L

4mmol/L

均值

9.5

10.5

标准差

0.7

酶活性百分比〔%〕

终浓度〔mmol/L〕

图2低浓度下亚硫酸钠对多酚氧化酶催化反响影响图

按照稀释比例参加不同体积的0.1mol/L抗坏血酸溶液，获得不同终浓度，按照酶活力测定方法测定酶活力。

酶活力百分比为反响后酶活力和原酶液酶活力的比值以下为实验结果：

表5：

低浓度下抗坏血酸对多酚氧化酶催化反响的影响

实验组酶活

0.5mmol/L

1mmol/L

2mmol/L

3mmol/L

4mmol/L

组一

10.5

组二

组三

7.5

10.5

表6：

抗坏血酸在不同低浓度下的各组数据的均值与标准差

0.5mmol/L

1mmol/L

2mmol/L

3mmol/L

4mmol/L

均值

9.5

10.5

标准差

1.2

1.9

1.2

0.7

酶活性百分比〔%〕

终浓度〔mmol/L〕

图3低浓度下抗坏血酸对多酚氧化酶催化反响影响图

按照稀释比例参加不同体积的0.1mol/L抗坏血酸溶液，获得不同终浓度，按照酶活力测定方法测定酶活力。

酶活力百分比为反响后酶活力和原酶液酶活力的比值以下为实验结果：

表7：

低浓度下谷胱甘肽对多酚氧化酶催化反响的影响

实验组酶活

0.5mmol/L

1mmol/L

2mmol/L

3mmol/L

4mmol/L

组一

283.5

280.5

273

270

271.5

组二

283.5

277.5

273

267

264

组三

279

271.5

268．5

267

表8：

谷胱甘肽在不同低浓度下的各组数据的均值与标准差

0.5mmol/L

1mmol/L

2mmol/L

3mmol/L

4mmol/L

均值

282

279

272.5

268.5

267.5

标准差

2.1

1.2

0.7

1.2

2.9

酶活性百分比〔%〕

终浓度〔mmol/L〕

图4低浓度下谷胱甘肽对多酚氧化酶催化反响影响图

按照稀释比例参加不同体积的0.1mol/L半胱氨酸，获得不同终浓度，按照酶活力测定方法测定酶活力。

酶活力百分比为反响后酶活力和原酶液酶活力的比值以下为实验结果：

表9：

低浓度下半胱氨酸对多酚氧化酶催化反响的影响

实验组酶活

0.5mmol/L

1mmol/L

2mmol/L

3mmol/L

4mmol/L

组一

16.5

组二

16.5

19.5

16.5

组三

16.5

19.5

表10：

半胱氨酸在不同低浓度下的各组数据的均值与标准差

0.5mmol/L

1mmol/L

2mmol/L

3mmol/L

4mmol/L

均值

18.5

标准差

0.7

1.2

1.41

0.7

酶活性百分比〔%〕

终浓度〔mmol/L〕

图5低浓度下半胱氨酸对多酚氧化酶催化反响影响图

按照稀释比例参加不同体积的0.1mol/L焦亚硫酸钠，获得不同终浓度，按照酶活力测定方法测定酶活力。

酶活力百分比为反响后酶活力和原酶液酶活力的比值，以下为实验结果：

表11：

低浓度下焦亚硫酸氢钠对多酚氧化酶催化反响的影响

实验组酶活

0.5mmol/L

1mmol/L

2mmol/L

3mmol/L

4mmol/L

组一

10.5

组二

10.5

组三

7.5

10.5

表11：

焦亚硫酸钠在不同低浓度下的各组数据的均值与标准差

0.5mmol/L

1mmol/L

2mmol/L

3mmol/L

4mmol/L

均值

10.5

标准差

1.8

0.7

1.41

1.2

酶活性百分比〔%〕

终浓度〔mmol/L〕

图6低浓度下焦亚硫酸钠对多酚氧化酶催化反响影响图

4讨论

如表1，2图1所示低浓度下亚硫酸氢钠对马铃薯多酚氧化酶的影响实验结果结果说明，虽然由于各组亚硫酸氢纳浓度变化较小使酶活性的的变化并不明显但是却有明显的抑制作用并有总体降低的趋势。

王伟等人也做过类似实验其实验结果说明在含0.5mmol/L的测活体系中,以各种浓度的NaHSO3为效应剂,研究NaHSO3对马铃薯　NaHSO3对马铃薯PPO催化体系氧化的吸收光谱的影响各组μmol/L,反响时间为5min。

在475nm波长处监测产物的生成量随反响时间的变化,分析酶催化反响的活力，是酶在不同浓度NaHSO3的测活体系中,测定的酶促反响进程曲线.不含NaHSO3的对照实验,得到一条通过原点的直线,说明酶催化反响不存在迟滞的现象,产物的形成量随着反响时间的延长而呈直线上升,其直线的斜率为酶的稳定态活力.后面几组

如表3，4图2所示低浓度下亚硫酸钠对马铃薯多酚氧化酶的影响实验结果结果说明，虽然由于各组亚硫酸纳浓度变化较小使酶活性的的变化并不明显但是却有明显的抑制作用并有总体降低的趋势。

如表4，5图3所示低浓度下抗坏血酸对马铃薯多酚氧化酶的影响实验结果结果说明，虽然由于各组抗坏血酸浓度变化较小使酶活性的的变化并不明显但是却有明显的抑制作用并有总体降低的趋势。

常成等人做过类似实验其实验结果说明Vc对PPO活性的影响,这种抑制作用很明显;在高PPO活性的实验组中,Vc对其活性抑制的稳定性和持续性特点是有差异的,这说明实验组PPO活性特点是比拟复杂的。

由于有的实验组的PPO活性明显高于另外实验组,那么Vc对该实验组中PPO活性的抑制也将是显著的因此在面条、馒头、饺子等食品加工时参加适量的Vc来抑制PPO活性以延缓或阻止其褐变是可行的〔常成，等2007〕

如表6，7图4所示低浓度下谷胱甘肽对马铃薯多酚氧化酶的影响实验结果结果说明，虽然由于各组谷胱甘肽浓度变化较小使酶活性的的变化并不明显但是却有明显的抑制作用并有总体降低的趋势。

少谦等人做过类似研究，其研究结果说明谷胱甘肽对多酚氧化酶的活性有明显的抑制作用，随着谷胱甘肽浓度的增加，多酚氧化酶的相对酶活不断降低，谷胱甘肽浓度为0.04mmol/L时，剩余酶活为91.85%，当浓度增加到0.3mmol/L，剩余酶活降为26.65%，使酶活下降50%的谷胱甘肽浓度〔IC50〕约为0.22mmol/L。

同时，谷胱甘肽使酶促反响的发生，产生一定的滞后，并随谷胱甘肽浓度的增加而显著延长。

当体系中谷胱甘肽含量为0.04mmol/L时，延滞时间为1min，含量增加到0.3mmol/L时，延滞时间延长到7min。

谷胱甘肽对多酚氧化酶的延滞现象，可能是由于谷胱甘肽可以与酶促氧化初产物醌类结合生成无色的物质，阻断了色素物质的形成，当儿茶素与多酚氧化酶氧化产生的醌类物质把谷胱甘肽消耗完后，醌类物质无法再转化成无色物质，此时反响体系开场生成有色物质，435nm波长处吸光度开场增加。

〔少谦，等2014〕

如表8，9图5所示低浓度下半胱氨酸对马铃薯多酚氧化酶的影响实验结果结果说明，虽然由于各组半胱氨酸浓度变化较小使酶活性的的变化并不明显但是却有明显的抑制作用并有总体降低的趋势。

少谦等人做过类似研究，其研究结果说明半胱氨酸对多酚氧化酶的酶促氧化也产生了明显的抑制作用，抑制作用随半胱氨酸浓度的增加而增大，当半胱氨酸浓度为0.02mmol/L时，剩余酶活为87.99%，浓度增加到0.2mmol/L时，剩余酶活仅为7.81%，其IC50值约为0.06mmol/L，远低于谷胱甘肽，可见半胱氨酸对多酚氧化酶的抑制作用强于谷胱甘肽。

同时，半胱氨酸也能使多酚氧化酶酶促反响产生一定的滞后，且随胱氨酸浓度增加，延滞时间延长，半胱氨酸浓度0.02mmol/L增加到0.2mmol/L，延滞时间由1min增加到5min。

其原因可能与谷胱甘肽一样，半胱氨酸也可以与酶促氧化初产物醌类反响生成无色物质。

一样浓度下，半胱氨酸的延滞时间比谷胱甘肽长，如0.08mmol/L时，二者延滞时间分别为2.5，1.5min，这说明谷胱甘肽与醌类物质反响能力更强。

〔少谦，等2014〕

如表10，11图6所示低浓度下焦亚硫酸钠对马铃薯多酚氧化酶的影响实验结果结果说明，虽然由于各组焦亚硫酸钠浓度变化较小使酶活性的的变化并不明显但是却有明显的抑制作用并有总体降低的趋势。

参考文献

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