分子生物学实验指导.docx

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分子生物学实验指导

分子生物学实验

指导

生物实验教学中心

主编：

刘宝琦

2009-06-01

目录

绪论分子生物学实验安全注意事项及分子生物学实验室所需要的仪器设备……………………………………………1

实验一植物基因组DNA的分离………………………………6

实验二RNA的分离……………………………………………11

实验三DNA/RNA的琼脂糖凝胶检测…………………………15

实验四DNA/RNA浓度、纯度的测定及浓度的调整…………21

实验五聚合酶链式反应（PCR）………………………………24

实验六随机扩增多态性DNA反应（RAPD）………………28

实验七甜菜M14品系AFLP分析………………………………32

实验八生物信息学………………………………………………49

绪论分子生物学实验安全注意事项及分子生物学

实验室所需要的仪器设备

一、安全事项

在实验室中安全是最重要的，分子生物学实验经常与毒性强，甚至致癌的试剂接触，所以进入分子生物学实验室的人员，必须了解所有的安全措施，并将实验室的操作置于最安全的条件下。

下面提到的几点须特别注意：

1．有毒的化学试剂

许多溶剂，像氯仿、异戊醇、异丁醇、正丁醇、甲醛和乙醚，应在通风橱中使用，并注意保护衣服、皮肤和呼吸道。

另一些试剂有可能是致癌物或诱变剂，像溴乙锭、甲酰胺，焦碳酸二乙酯（DEPC）等，在操作中应注意防护，并注意使用后的处理。

各种试剂在使用前都应认真看一下使用说明，特别是对一些试剂盒，掌握有关知识后，方可使用。

2．放射性

有些实验需要使用32P或其它放射性物质，在实验中要确实保证遵守使用这类物质的所有守则；对放射性废弃物也要同样小心。

3．生物学管制

虽然现代生物技术领域的发展已经带来了巨大的社会和经济效益，生物技术所具有的巨大力量也给人类社会带来了许多意想不到的冲击，它既可以造福人类，也可能用来制造致命的生物武器，破坏整个人类社会的和平。

1976年6月30日，美国国家卫生研究院制订并正式公布了“重组DNA研究准则”，规定禁止若干类型的重组DNA进行实验外，还制订了许多具体的条文规定。

这些规定主要包括对生物体的物理防护和生物防护。

物理防护主要是：

实验室必须有技术熟练的工作人员，具有正确的物理防护设备，如负压装置，高压灭菌及安全操作箱等等。

生物防护主要包括选择非病原的生物体作外源DNA的克隆工具，或者对微生物进行精细的遗传操作，减低其在环境中存活和繁殖的可能性。

4．设备方面的危险

实验室内所有设备都有潜在的危险，操作方法不正确，就会出现意外，所以实验室中的所有仪器的使用都应在老师的指导下进行，或者阅读本仪器的使用说明书后，方可使用。

二、分子生物学实验室所需要的仪器设备

1．灭菌

在分子生物学实验中，许多溶液、玻璃器皿和微量移液器枪头都要高压灭菌，特别是在做RNA有关实验时，更需要干热及湿热高压灭菌，以去除RNA酶，电热干燥箱主要用于干热灭菌；而高压灭菌锅主要用于高压湿热灭菌。

2．离心机

几乎每个分子生物学实验都要用到离心机，一个分子生物学实验室至少需要4台离心机，分别为一台低速（20000r/min）冷冻离心机、一台超速（20000-80000r/min）离心机、一台可离心1.5mL微量离心管的微型（MINI）离心机、一台大容量、低速度的离心机用来收获大量的细菌培养液。

3．冷冻设备

至少需要一台普通冰箱（4℃，-20℃），如有条件，还需要一台-80℃冰箱。

许多动物、植物、微生物的样本以及试剂的贮存需要在低温或者超低温下贮存。

制冰机也是很必要的，因为许多反应是在冰上进行的。

4．光学测量

紫外/可见分光光度计主要用来检测DNA/RNA的浓度和纯度，有条件的实验室用DNA/RNA计算器来代替分光光度计，使用起来更方便。

5．天平

分析天平和制备天平，天平的精度要达到千分之一或者万分之一。

6．计算机和打印机

主要用来进行RAPD等实验的聚类分析及其他软件分析。

7．凝胶电泳装置

至少有一套可满足不同分子量大小的水平电泳槽和电泳仪，对于从事大规模测序的研究人员需要配备一套测序凝胶装置。

还应有一套用于聚丙烯酰胺蛋白质凝胶的垂直电泳仪及电泳槽，根据需要，配备一套用于双向蛋白质凝胶的特制电泳仪。

8．恒温箱（37℃）

用于培养细菌

9．温控摇床

用于培养液的培养

10．磁力搅拌器（最好带加热功能）

主要用于试剂的配制

11．微波炉

用于熔化琼脂和琼脂糖

12．PH计（酸度计）

试剂配制

13．0.1μL-5000μL范围的微量移液器

一般都为可调移液器,可调范围分别为0.1μL—2.5μL、5μL—10μL、10μL—100μL、20μL—200μL、100μL—1000μL、1000μL—5000μL

14．PCR仪（热循环仪）

用于PCR扩增反应

15．组织光照培养箱

用于组织培养

16．紫外观测仪

紫外观察凝胶板

17．旋涡混合器（Vortex）

混合微量试剂

18．水浴装置

至少需要两台水浴，DNA的提取及许多反应都要在水浴中进行。

19．纯水仪

分子生物学所用水均为纯水，水的电阻率要达到MΩ级

20．玻璃器皿及塑料制品

大小烧杯、烧瓶、试剂瓶、量筒、吸管、搅拌棒、研磨器、离心管（1.5mL、0.5mL）、PCR管、移液器枪头（Tip）等

21．相应的分子生物学试剂及试剂盒

三、一些常用精密仪器的使用方法

1．微量移液器的使用方法

以Eppendorf型微量移液器为例实物讲解

2．冷冻离心机的使用方法

以BeckmanMicrofugeR型冷冻离心机为例实物讲解

3．PCR仪的使用方法

以PE9700型PCR仪为例实物讲解

4．纯水仪的使用方法

以MiLLi-Q型纯水仪为例实物讲解

四、思考题

1．分子生物学实验中要注意的安全事项有哪些？

2．微量移液器的正确使用方法。

实验一植物基因组DNA的分离

一、相关知识

分离植物DNA是分子生物学实验的一个基本要求。

不同的研究目的对DNA的纯度和量的要求不尽相同。

例如，在构建用于筛选植物基因或其他诸如RFLP这样的遗传标记基因组DNA文库时，需要使用高相对分子质量、高纯度的DNA；而在进行遗传分析时，对DNA的纯度要求就可以低一些。

一般而言，一个好的DNA分离程序应符合以下三个主要标准：

（1）所得DNA的纯度应满足下游操作的要求，用于RFLP分析的DNA，其纯度的要求为可用限制性内切酶完全酶解并可成功地转移到膜上进行Southern杂交；用于PCR分析的DNA则不应含干扰PCR反应的污染物；

（2）所得DNA应当完整，电泳检查时可给出精确性高、重复性好的迁移带型；（3）所得的DNA应有足够的量。

如果对植物进行大规模筛选，还应当满足操作程序应当快速、简便、价格低廉，并尽可能避免使用有毒试剂这样的要求。

二、实验原理

植物DNA的提取程序应包括以下几项：

首先，必须粉碎（或消化）细胞壁以释放出细胞内溶物。

分离总基因组DNA常用的破壁方法是将植物组织胀水，然后研磨成细粉；或者将新鲜植物组织在干冰或液氮中快速冷冻后，用研钵将其磨成粉沫。

其次，必须破坏细胞膜使DNA释放到提取缓冲液中，这一步骤通常靠诸如SDS或CTAB一类的去污剂来完成。

去污剂还可以保护DNA免受内源核酸酶的降解。

通常提取缓冲液中还包含EDTA，它可以螯合大多数核酸酶所需的辅助因子——镁离子。

最后，一旦DNA释放出来，其剪切破坏的程度必须要降到最低。

剧烈振荡或Tip头小孔快速抽吸都会打断溶液中高相对分子质量的DNA。

分离高相对分子质量的DNA还只是工作的一部分。

因为在粗提物中往往含有大量RNA、蛋白质、多糖等杂质，这些杂质有时很难从DNA中除去。

大多数蛋白可通过氯仿或苯酚处理后变性、沉淀除去，绝大部分RNA则可通过经处理过的RNase除去。

但多糖类杂质一般较难去除，这些杂质浓度高时，往往用一些DNA纯化试剂盒来进一步纯化DNA。

三、实验方法

1．向10mL离心管中加入5mL的2×CTAB（十六烷基三乙基溴化铵），60℃保存预热，预热后加入10μL0.2%的巯基乙醇,巯基乙醇的作用为抗氧化剂。

2．用液氮将研棒、研钵预冷，将0.5-1.5g叶片放入研钵，捣碎成粉末，转移到①中的离心管中，轻轻转动离心管，使植物组织在提取缓冲中均匀分离,置于60℃水浴摇床中保温30min。

3．加入等量5mL氯仿，于空气摇床中摇15min，使管内混合物成乳浊液，此时蛋白质充分接触氯仿与核酸分开，室温4000rpm离心15min分相，含蛋白质胞碎片的有机相位于管的下面，上层为含核酸的水相。

4．离心后，用去头的Tip（怕破坏DNA长链）将上清液转移到新的离心管中，将2/3量即3.3mL预冷的异丙醇与之缓慢混匀，20℃，8000rpm离心10mim，沉淀DNA。

5．移去上清液，干燥后（用无菌操作台通风干燥）加1mLTE溶解沉淀。

6．加入5μLRNase（10mg/mL）37℃保温45min，以去除DNA中的RNA。

7．加入等量（1mL）苯酚—氯仿—异戊醇（25:

24:

1），，室温空气摇床缓缓混匀10min，室温下4000rpm离心10min，（RNase也是一种蛋白质），进一步去除蛋白质,用去头的200μLTip将上清转移到一支新的离心管中。

8．加入1/2量（0.5mL）苯酚—氯仿—异戊醇（25:

24:

1）,摇床缓慢混匀10min，4000rpm离心10min，将上清转移到新的离心管中。

9．加入等量（0.8-1mL）氯仿，摇床摇匀10min，4000rpm离心10min，将上清液移到新管中，这一步可除去水相中残留的酚。

10．加入1/10量（0.1mL）3MNaAc，2.5倍量（2.5mL）冷乙醇，缓慢混匀，DNA沉淀析出，4000rpm离心10min。

11．弃去上清，干燥30-60min，加入0.5-1mLTE，4℃溶解并保存。

四、实验要点

1．CTAB溶液在低于15℃时会析出沉淀，因此在将其加入冷冻的植物材料中之前必须预热。

2．在最适条件下，DNA—CTAB沉淀呈白色纤维状，很容易一下子就从溶液中钩出。

不过，某些植物种的DNA沉淀中可能含有杂质，特别是多糖，使DNA沉淀呈絮状或胶状，这种情况下可能需要稍事离心才能得到DNA.—CTAB沉淀。

3．饱和酚虽然可有效地使蛋白质变性，但酚不能完全抑制RNA酶的活性,而且酚可以溶解含poLy（A）的mRNA。

如果用苯酚和氯仿的混合液，可减轻这两种现象，同时可加入适量的异戊醇（苯酚—氯仿—异戊醇=25:

24:

1），异戊醇的作用是消泡，并使蛋白质层紧密，使水相和有机相分层较好。

五、所需仪器、耗材

1．1.5mL离心管

2．60℃水浴，37℃水浴

3．研钵、研棒

4．空气摇床

5．冷冻离心机

6．超净工作台

7．冰箱

8．去头的10μLTip

9．去头的200μLTip

10．吸水纸

11．液氮罐

六、所需试剂

1．CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）

2．巯基乙醇

3．液氮

4．氯仿

5．冷异丙醇

6．TE缓冲液

7．RNase

8．苯酚—氯仿—异戊醇（25:

24:

1）

9．3MNaAC

10．冷乙醇

七、试剂配制

1．1MTris—HCl，pH=8.0

Tris—HCl:

121.1g60.55g

浓HCl:

42mL21mL

加H2O至:

1L500mL

→高压灭菌15min

2．0.5MEDTANa2·2H2O，pH=8.0

EDTANa2·2H2O:

186.1g93.05g55.83g

加H2O水至:

1L500mL300mL

用NaOH调pH=8.0（约需20gNaOH颗粒）

→高压灭菌

3．2×CTAB

40.9gNaCl；10gCTAB，50mL1MTris-HCl（pH=8.0）；

20mL0.5MEDTA（pH8.0）定容至500mL，高压灭菌。

4．TE缓冲液

1MTris-HCl5mL+0.5MEDTA1mL→加水定容至500mL，高压灭菌。

5．3MNaAC（pH=5.2）

在200mL水中溶解102g三水乙酸钠，用冰乙酸调节pH值至5.2，加水定容至250mL，高压灭菌。

6．0.2%巯基乙醇

100mL水中加入0.2mL巯基乙醇。

7．20×SSC

NaCl:

175.3g87.65g

柠檬酸钠:

88.2g44.1g

10NNaOH:

数滴调pH=7.0

ddH2O:

1L500mL

8．10mg/mLRNaseA

取10mgRNaseA溶于1mL2×SSC（0.1mL20×SSC定容至1mL）中，沸水煮10分钟，冷却，分装-20℃保存。

八、思考题

1．提取缓冲液中CTAB或EDTA的作用是什么？

1、

（1）CTAB的作用是使DNA沉淀。

在最适条件下，DNA—CTAB沉淀呈白色纤维状，很容易一下子就从溶液中钩出。

不过，某些植物种的DNA沉淀中可能含有杂质，特别是多糖，使DNA沉淀呈絮状或胶状，这种情况下可能需要稍事离心才能得到DNA—CTAB沉淀。

（2）EDTA可以跟绝大多数核酸酶的辅助因子Mg2+螯合，让核酸酶无活性，防止其降解DNA。

2．怎样去除DNA杂质中的蛋白质和RNA？

2、

（1）用氯仿、苯酚和异戊醇使蛋白质变性沉淀而除去，氯仿使蛋白质与之结合而不与DNA结合，苯酚使蛋白质变性，异戊醇消泡，使蛋白质层紧密，是有机相和水相分离容易。

（2）使用RNase除去RNA。

3．纯化DNA步骤中，苯酚、氯仿、异戊醇各有什么作用？

为何交替使用？

3、

（1）氯仿使蛋白质与之结合而不与DNA结合，苯酚使蛋白质变性，异戊醇消泡，使蛋白质层紧密，是有机相和水相分离容易。

饱和酚虽然可有效地使蛋白质变性,但酚不能完全抑制RNA酶的活性,而且酚可以溶解含poLy（A）mRNA。

如果用苯酚和氯仿的混合液，可减轻这两种现象，同时可加入适量的异戊醇（苯酚—氯仿—异戊醇=25:

24:

1），异戊醇的作用是消泡，并使蛋白质层紧密，使水相和有机相分层较好。

（2）交替使用先用苯酚是蛋白质变性，再用氯仿与蛋白质结合，最后用异戊醇消泡，使分层较好。

实验二RNA的分离

一、RNA和无RNA酶的环境

在植物细胞中存在不同类型的RNA。

rRNA占总RNA的70%;tRNA在细胞中的含量也较丰富（15%），mRNA含量为细胞总RNA的1-5%,大多数真核细胞mRNA在其3'端均有一多聚A（PolyA）尾巴。

在进行RNA操作时，需要特别注意RNA被RNA酶降解。

由于RNA酶存在于所有的生物中，并且RNA酶是一种耐受性很强的酶，传统的高温灭菌的方法不能使之失活。

RNA酶的污染既可能源自内部，在植物的某些组织如根中RNA酶含量特别高，也可能源自外部，如玻璃器皿，缓冲液和操作者的皮肤。

其中人的皮肤表面有大量的RNA酶。

所以应尽可能在无RNA酶的环境下进行有关RNA操作,具体措施如下：

1．分离RNA以前，将所用玻璃制品及取样剪刀、镊子等置于烤箱在300℃下烧烤4h或180℃烘烤8h以灭菌。

2．应用焦碳酸二乙酯处理过的水（DEPC-SDW）进行溶液的配制，并高压灭菌20min。

DEPC是RNA酶的强烈抑制剂。

DEPC-SDW配制如下：

100mL水中加入0.2mLDEPC原液，放于摇床上充分混匀并在室温下作用数小时，然后高压灭菌15min。

3．所用的Tip、离心管、PCR管等塑料制品都用0.05%DEPC-H2O处理：

灌满DEPC-H2O，37℃放置2小时，用DEPC-SDW冲洗，并于100℃干烤15分钟并高压灭菌15分钟。

4．人的汗液中含有RNA酶，故在所有步骤中均应戴手套并经常更换，通常使用的实验室设备诸如移液吸管等应浸泡于酒精中，使用前晾干。

二、实验原理

总RNA提取采用一步法进行（TRIzoL试剂），试剂中有酚、胍和硫代氰酸盐，是由Chomczyanski和Sacchi发展的一种改进的提取RNA的方法。

在进行样品均质化和溶解过程中，TRIzoL试剂可以可以破碎细胞，破坏核蛋白复合体，使RNA顺利地解脱出来溶进缓冲液，同时TRIzol试剂可以保持RNA的完整性。

由于RNA在碱性条件下不稳定，因而在整个提取RNA过程中体系始终保持酸性至中性，而在酸性条件下DNA极少发生解离，DNA同蛋白质一起变性后被离心下来，这时溶液分为液体相和组织相，RNA可以完整地保存在液体相中。

在提取液体相后，加入异丙醇来沉淀RNA，最后用75%乙醇来洗RNA。

三、实验方法

（一）均质化及分相

1．玻璃研磨器中放1mLTRIzolRNA提取液

2．冰上研磨

3．研磨液移入1.5mL离心管，室温放置5分钟。

4．加入0.2mL氯仿，盖好盖，用手（或vortex）剧烈振动15秒。

5．再在室温下放置2-3分钟。

6．4℃条件下12000g离心15min，离心管中共分三相，上层为RNA液体相，中层为DNA及碎破组织相，下层为酚-氯仿相。

7．上清液RNA液体相移入新的离心管中。

（二）RNA沉淀

8．与0.5mL的异丙醇混匀后，室温放置10分钟（洗氯仿，沉淀RNA）。

9．4℃离心12000g10分钟。

（三）洗涤

10．倒掉上清液后加入1mL的75%乙醇振荡（vortex）洗RNA（洗掉异丙醇）。

11．4℃条件下7500g离心5分钟。

（四）重溶RNA

12．去掉乙醇。

13．干燥10分钟。

14．用DEPC-SDW50μL溶解RNA沉淀，可在55-60℃条件下温育10min。

15．加入3倍体积的无水乙醇（150μL）放入-20℃或-80℃下保存。

四、所需仪器、耗材

1．180℃烘箱

2．4℃离心机

3．玻璃研磨器

4．离心管

5．移液器

6．枪头

7．饭盒

8．滤纸

9．玻璃器皿

10．高压灭菌锅

11．沙布

12．一次性手套

13．水浴

14．vortex

15．白瓷盘

五、所需试剂

1．TRIzol试剂

试剂中有酚、胍和硫代氰酸盐，是由Chomczyanski和Sacchi发展的一种改进的提取RNA的方法。

在进行样品均质化和溶解过程中，TRIzoL试剂可以可以破碎细胞，破坏核蛋白复合体，使RNA顺利地解脱出来溶进缓冲液，同时TRIzol试剂可以保持RNA的完整性。

2．氯仿

3．异丙醇

4．75%乙醇（用DEPC-SDW配制）

用焦碳酸二乙酯处理过的水（DEPC-SDW）进行溶液的配制，并高压灭菌20min。

DEPC是RNA酶的强烈抑制剂。

5．DEPC-H2O

六、思考题

1．TrizoL试剂在实验中的作用是什么？

1、试剂中有酚、胍和硫代氰酸盐，在进行样品均质化和溶解过程中，TRIzoL试剂可以可以破碎细胞，破坏核蛋白复合体，使RNA顺利地解脱出来溶进缓冲液，同时TRIzol试剂可以保持RNA的完整性。

2．实验过程中，加入氯仿后，溶液共分为哪三相？

加入0.2mL氯仿，盖好盖，用手（或vortex）剧烈振动15秒。

再在室温下放置2-3分钟。

4℃条件下12000g离心15min，离心管中共分三相，上层为RNA液体相，中层为DNA及碎破组织相，下层为酚-氯仿相。

3．怎样达到尽可能的无RNA酶的环境？

3、在进行RNA操作时，需要特别注意RNA被RNA酶降解。

由于RNA酶存在于所有的生物中，并且RNA酶是一种耐受性很强的酶，传统的高温灭菌的方法不能使之失活。

RNA酶的污染既可能源自内部，在植物的某些组织如根中RNA酶含量特别高，也可能源自外部，如玻璃器皿，缓冲液和操作者的皮肤。

其中人的皮肤表面有大量的RNA酶。

所以应尽可能在无RNA酶的环境下进行有关RNA操作,具体措施如下：

1．分离RNA以前，将所用玻璃制品及取样剪刀、镊子等置于烤箱在300℃下烧烤4h或180℃烘烤8h以灭菌。

2．应用焦碳酸二乙酯处理过的水（DEPC-SDW）进行溶液的配制，并高压灭菌20min。

DEPC是RNA酶的强烈抑制剂。

DEPC-SDW配制如下：

100mL水中加入0.2mLDEPC原液，放于摇床上充分混匀并在室温下作用数小时，然后高压灭菌15min。

3．所用的Tip、离心管、PCR管等塑料制品都用0.05%DEPC-H2O处理：

灌满DEPC-H2O，37℃放置2小时，用DEPC-SDW冲洗，并于100℃干烤15分钟并高压灭菌15分钟。

4．人的汗液中含有RNA酶，故在所有步骤中均应戴手套并经常更换，通常使用的实验室设备诸如移液吸管等应浸泡于酒精中，使用前晾干。

实验三DNA/RNA的琼脂糖凝胶检测

一、实验原理

分离出细胞的总RNA或部分RNA之后，根据它们相应的迁移可以通过电泳分辨RNA分子，是检测RNA分子是否降解的关键一步。

电泳是现在用于分离和纯化DNA/RNA片段的最常用技术。

当制备好的一块“胶”即一块包含电解质的多孔支持介质并把它置于静电场中，DNA/RNA分子将向阳极移动，这是因为DNA/RNA分子沿其双螺旋骨架两侧带有富含负电荷的磷酸根残基。

当DNA/RNA长度增加时，来自电场的驱动力和来自凝胶的阻力之间的比率就会降低，不同长度的DNA/RNA片段就会出现不同的迁移率。

因而就可依据DNA/RNA分子的大小使其分离。

依据制备凝胶的材料，凝胶电泳可分成两个亚类：

琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

聚丙烯酰胺分离小片段DNA/RNA（5—500bp）效果最好，其分辨力极高，相差1bp的DNA片段就能分开，其不足之处为制备和操作较为困难。

琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。

用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kb的DNA/RNA片段。

（一）琼脂糖凝胶

1．琼脂糖浓度

采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子。

2．EB染料的存在

溴化乙锭（EB）是一种吖啶类染料，它在紫外灯照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的DNA。

含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围：

凝胶中的琼脂糖含量[%（W/V）]DNA/RNA分子的分离范围（kb）

0.35—60

0.61—20

0.70.8—10

0.90.5—7

1.20.4—6

1.50.2—3

2.00.1—2

3．电泳缓冲液的组成

有几种不同的缓冲液可用于电泳，分别为Tris—乙酸（TAE）、Tris—硼酸（TBE）或Tris—磷酸（TPE），其浓度约为50mmoL/L，PH为7.5—7.8,这些缓冲液均含有EDTA。

这些缓冲液通常配制成浓缩液，贮存于室温。

常用的电泳缓冲液的配制：

缓冲液

使用液

浓贮存液（每升）

Tris—乙酸（TAE）

1×：

0.04moL/LTris—乙酸

0.0