原核表达实验流程.docx

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原核表达实验流程

原核表达实验流程

原核表达流程：

第一步

目的基因获取DH5a感受态制备

PCR扩增

pGEM-T载体

重组载体1DH5a感受态细胞

转化

转化细胞1

抽取质粒进行电泳

酶切验证检验阳性

（阳性）转化细胞1

酶切，获取目的基因

Pet28a/DH5a载体

重组

重组载体2

第二步

重组载体2DH5a感受态细胞

转化

转化细胞2

抽取质粒进行电泳

酶切验证检验阳性

（阳性）转化重组载体3

BL21感受态细胞

转化细胞3

诱导表达

蛋白质提取

SDS-PAGE电泳检测呈阳性

目的蛋白

一.感受细胞的制备

体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。

为了提高受体菌摄取外源DNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。

目前主要采用电转化法和CaCl2法将外源DNA导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2感受态细胞。

本实验制备的是电转化感受态细胞。

实验原理：

对于电转化法，因利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。

（109～1010转化子/μgDNA）

实验材料：

LB培养基（根据需要确定配制的量）：

10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/lNaCl，加水至1000ml，高压灭菌，保存在室温。

无抗生素LB琼脂糖平板培养基（根据需要确定配制的量）：

10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/lNaCl，15g/l琼脂粉，加水至1000ml，高压灭菌；铺平板，冷却后在37℃培养24小时，保存在室温。

10％甘油：

10ml甘油加入90mlddH2O水，混匀，高压灭菌。

其他：

DH5α大肠杆菌，灭菌玻璃平皿若干，接菌环，加100mlLB液体培养基的500ml灭菌锥形瓶一个，灭菌50ml离心管若干，冰盒，移液器，灭菌移液器吸头，灭菌Eppendorf管等。

实验仪器

酒精灯，超净工作台，温控摇床，4℃离心机等。

实验方法

（1）将大肠杆菌DH5a贮存菌液在无抗的LB平板划线，37℃培养箱过夜培养（培养好的平皿放入4℃冰箱贮存备用）。

（2）从平板上挑取单菌落接种于5mL无抗生素LB培养基中，37℃振荡培养过夜；。

（3）按照1:

50比例接种过夜菌液至50mLLB培养基中，37℃剧烈振荡培养3小时左右，至OD600达0.3-0.6，最好是0.4；

（4）当OD600值达到0.4左右时，迅速将菌液冰浴15~30分钟，不时缓慢摇匀以保证内容物充分冷却。

将离心管置于冰上预冷，为下一步做准备。

（为获得最大效率的转化，在整个操作过程中菌液的温度不超过4℃是关键，以下步骤务必在超净工作台和冰上操作）

（5）将细菌培养物转移至冰冷的50mL离心管中，4℃用JA转头（或与之相当的转头）以2500rpm/min离心15min，以回收细胞。

倒去培养液，用40mL冰冷的纯水重悬沉淀。

（6）4℃用JA转头（或与之相当的转头）以2500rpm/min离心20min，以回收细胞。

倒去培养液，用25mL冰冷的10%甘油重悬沉淀。

（甘油有保存细胞的作用）

（7）4℃用JA转头（或与之相当的转头）以2500rpm/min离心20min，以回收细胞。

倒去培养液，用1mL冰冷的10%甘油重悬沉淀。

（倾倒培养液时要小心，10%甘油中的细菌沉淀附着力降低。

）

（8）将细胞按40μL等份装入微量离心管，直接使用或-80℃保存

（9）感受态细胞的检测：

取感受态细胞分别涂布含有氨苄青霉素和卡那霉素抗性的LB平板，

37℃培养12－16小时，观察感受态细菌是否有污染；

（10）取1μg超螺旋质粒转化制备的感受态，检测转化效率（一般情况下，没有必要精确计算，可用根据经验估计）。

注：

以上操作全部在无菌条件4℃冰浴下进行。

技术要点

1）无菌操作；

2）原始菌种要保证质量；

3）感受态细胞分装保存时不宜体积太大；

4）细菌活化之后，生长密度最好保证OD600为0.4-0.6；

5）冰上分装感受态细胞；

6）在－80℃保存感受态细胞，至少半年仍然可有较好的转化效率，但也不宜过久；

7）防止携带某种质粒的其它细菌污染；

8）防止其它杂菌污染。

二.DNA连接和转化

基本原理

T4DNA连接酶最初分离于T4噬菌体感染的大肠杆菌，可催化DNA5’磷酸基与3’羟基之间形成磷酸二酯键。

在本试验中，将克隆载体pGEM-T与外源DNA片段用T4连接酶连接，可将外源DNA片段插入pGEM-T质粒中，构建外源DNA的克隆载体。

质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。

将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。

可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。

电转化法：

外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于DNA等大分子进入。

同时DNA在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。

实验材料

质粒DNA，pGEM-T载体或PET表达载体，T4DNA连接酶，连接酶缓冲液10×

buffer或2×快速连接缓冲液，灭菌纯净水，感受态细菌，LB液体培养基10ml，

含有抗生素的LB琼脂平板培养基3个，低温冰盒，微量移液器，Eppendorf管，

一次性手套、涂菌棒等。

实验仪器

恒温水浴，温控摇床，台式离心机，37℃细菌培养箱等。

实验方法

建立连接反应

（1）准备经过酶切处理的外源DNA片段和质粒载体；连接前先电泳确定待连接载体与片段的浓度

（2）配制连接反应体系（10μl反应体系）

10×连接Buffer1μl（或2×快速连接Buffer5μl）

T4连接酶1μl

待连接的样品xμl（PCR产物或胶回收产物，载体与片段的mol比为1∶3-10）

载体8-xμlor4-xμl

（3）混匀样品并短暂离心使样品全部沉于管底。

（4）将离心管置于连接酶要求的温度孵育适当的时间，一般为16℃，反应12－16小时。

或4℃连接过夜16h以上（根据不同公司的酶的要求而定）。

电转化法制备大肠杆菌感受态细胞

（1）从-80℃中取40μl感受态细胞于冰浴上融化5~10min，并将电转化杯冰浴。

（2）加入0.1~1μL纯质粒或2~5μL连接产物，轻轻吹打混匀，用移液器轻轻吸打均匀，置冰上。

（3）将要转化的混合物加入预冷的1mm的电转化杯中，电转化仪选择1800V作为输出电压，立即按下按纽电击。

（4）将电击后的转化细胞加入800μLSOC培养基中，于37℃恒温摇床上200rpm×1h温育。

（5）将菌液4000rpm/min离心3min，留200μL上清将菌体打散，均匀涂布于含适当抗生素的琼脂平板表面（根据质粒所携带抗生素抗性基因而定），平板于37℃倒置培养过夜。

i.注：

新倒的平板可于37℃培养箱中预先放置数小时至过夜干燥，放在4℃冰箱中的培养基可以先拿出来放置，让其温度升到室温。

ii.当转化的是TA克隆连接产物时可在固体培养基上加入4μL1MIPTG和40μLl20mg/mlX-gal以进行蓝白斑筛选。

三、重组基因的检测

基本原理

质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。

质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。

质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：

细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。

本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程，检测重组基因是否转化成功。

在含质粒的大肠杆菌混悬液中加入SDS和NaOH使菌体充分裂解，并使蛋白质和染色体DNA变性，加醋酸钠中和变性蛋白，染色体DNA及SDS沉淀，质粒DNA存于上清中，然后用乙醇进一步纯化质粒。

实验材料

1）大肠杆菌DH-5α或BL21

2）溶液I：

50mM葡萄糖；10mMEDTA；25mMTris-HCl，pH8.0。

（Tris：

三羟甲基氨基甲烷）。

3）溶液II：

0.2MNaOH;1%SDS,PH12.5。

4）溶液III：

3MNaAC；2M乙酸，pH4.8（盐酸调pH）。

5）TE缓冲液：

10mMTris-HCl，pH8.0；1mMEDTA.。

6）RNA酶A溶液：

10mg/mlRNA酶A，用TE配制，100°C煮10分钟，灭活DNA酶。

7）LB培养基：

10g胰蛋白胨，5g酵母粉，5gNaCl加水至1000ml，用1MNaOH调pH至7.5，高压灭菌。

8）氨苄青霉素：

用去离子水配成100mg/ml的储存液，过滤除菌，－20℃分装保存。

9）LA培养基：

在LB培养基中加入终浓度100μg/ml的氨苄青霉素。

10）70%乙醇

实验仪器

超净工作台，台式离心机，电泳仪

实验方法

1.取1.5ml细菌培养物于已灭菌的EP管中，12000rpm离心1分钟，弃上清液，使细菌沉淀尽量干燥；

2.将细菌沉淀重悬于用冰预冷的100µl溶液I（50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTApH8.0，25mmol/LTris-HClpH8.0）中，剧烈振荡；

3.加入200µl新配制的溶液II（0.2mol/LNaOH，1％SDS（m/v）），盖紧EP管口，快速颠倒离心管5次，以混合混合物，确保离心管的整个内表面与溶液II接触，不要涡旋，置于冰浴中；

4.加入150µl预冷溶液III（每100ml的溶液III中含60ml5mol/L乙酸钾，11.5ml冰乙酸，28.5mLH2O），盖紧EP管口，反复颠倒数次，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3~5分钟；

5.在最大转速下离心5min，取上清液于另一新EP管；

6.用两倍体积的乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合于室温放置2分钟，最大转速离心5分钟；

7.小心吸去上清液，将离心管倒置于滤纸上，以使所有液体都流出，在将附于管壁的液滴除尽；

8.加1ml70％乙醇洗涤沉淀，振荡混合，用12,000g离心2分钟，弃上清，将开口的EP管置于室温使乙醇挥发，直至EP管中内没有可见的液体存在（5～10分钟），用适量的TE或ddH2O溶解；

9.用0.5µl的RNase37℃温育5~10分钟；

10.电泳鉴定。

技术要点

1）每一步都要充分混匀，为获得高产量DNA，第一步需使菌体完全重悬。

2）加入碱溶液后，反复混匀使细菌充分裂解，但需要轻柔，一旦裂解（液体变清亮）必须马上加乙酸缓冲液中和。

3）70%乙醇洗涤时，离心后应小心地将上清倒掉，注意这时DNA沉淀较疏松，易从管壁上脱落。

四、质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳

基本原理

DNA在琼脂糖凝胶介质中，在电场作用下，从负极向正极移动，泳动速度取决于DNA的大小和构型，电泳后经Gel-red染色，DNA可与其结合，在紫外光下发出荧光，DNA的琼脂糖凝胶电泳可用于DNA的鉴定，定量及纯化。

2．材料、仪器

1）TAE电泳缓冲液

浓储存液50×：

242gTris碱；57.1ml冰乙酸,100ml0.5mol/LEDTA（PH8.0）

使用液1×：

0.04mol/LTris--乙酸;0.001mol/LEDTA

2）GEBS样本液

6×缓冲液:

15%聚蔗糖（Ficoll）（400型，Pharmacia）0.25%溴酚蓝

3）溴化乙锭

配成10mg/ml溶液，双蒸水配制，避光保存，用时1：

20000稀释。

溴化乙锭为致癌剂，配

制时防止皮肤接触。

4）仪器

DYY-III型稳压稳流电泳仪、水平电泳槽、微波炉、离心机，北京六一厂生产。

凝胶成像系统，上海Tanon生物技术公司。

3．方法

1）0.8%琼脂凝胶板的配制：

取0.6g琼脂糖加80mlTAE（1×），20ml水，微波炉加热融化3分

钟，将其冷却至55°C-65°C，倒入制胶槽中。

2）充分凝固后从制胶槽中卸下凝胶板，放入电泳槽，加入TAE（1×），使其液面略高于琼脂糖板，拨出样品梳。

3）DNA样品10μl加5μlGEBS样本液，在腊面纸上混匀，全部加样于琼脂糖板的样品孔中。

4）稳压电泳80V约2小时，使溴酚蓝指示剂泳动至适当位置，1-5V/cm。

5）取出凝胶板置溴化乙锭溶液中染色20分钟。

6）在凝胶成像仪观察结果。

7）琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶的比较：

不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp-50kb的DNA。

聚丙烯酰胺凝胶分离小片段DNA（5-500bp）效果最好。

聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶相比有三个主要优点：

基因分子生物学实验指导

（1）分辨力强，长度仅相差0.2%（即500bp中的1bp）的DNA分子即可分开；

（2）装载DNA量大，一个样品槽可装载10ug的DNA；

（3）从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高。

4．技术要点

1）选择琼脂糖凝胶浓度取决于所鉴定DNA的大小，小片段DNA应用高浓度凝胶，大片段则用低

浓度凝胶，在1%的琼脂糖凝胶中溴酚蓝的泳动速度与500bp的双链线状DNA一致。

不同浓度琼脂糖凝胶及其可分离的线性DNA大小范围见下表1。

表1不同浓度琼脂糖凝胶及其分离线性

无抗生素LB琼脂糖平板培养基（根据需要确定配制的量）：

10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/lNaCl，15g/l琼脂粉，加水至1000ml，高压灭菌；铺平板，冷却后在37℃培养24小时，保存在室温。

含有抗生素LB琼脂糖平板培养基（根据需要确定配制的量）：

10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/lNaCl，15g/l琼脂粉，加水至1000ml，高压灭菌；当培养基降温至50℃左右，加入终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素或50μg/ml卡那霉素，并铺平板，冷却后在37℃培养24小时，保存在室温。