原核表达实验流程.docx

1、原核表达实验流程原核表达实验流程原核表达流程：第一步目的基因获取 DH5a感受态制备 PCR扩增 pGEM-T载体 重组载体1 DH5a感受态细胞 转化 转化细胞1 抽取质粒进行电泳 酶切验证检验阳性 （阳性）转化细胞1 酶切，获取目的基因 Pet28a/DH5a载体 重组 重组载体2第二步重组载体2 DH5a感受态细胞 转化 转化细胞2 抽取质粒进行电泳 酶切验证检验阳性 （阳性）转化重组载体3 BL21感受态细胞 转化细胞3诱导表达 蛋白质提取 SDS-PAGE电泳检测呈阳性 目的蛋白一.感受细胞的制备 体外连接的 DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受体菌摄取外源DNA

2、 的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和 CaCl2 法将外源DNA 导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2 感受态细胞。本实验制备的是电转化感受态细胞。 实验原理： 对于电转化法，因利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。(109 1010转化子/g DNA)实验材料： LB 培养基（根据需要确定配制的量）： 10g/l 胰蛋白胨，5g/l 酵母提取物，10g/l NaCl，加水至 1000ml，高压灭菌，保存在室温。无抗

3、生素LB琼脂糖平板培养基（根据需要确定配制的量）： 10g/l 胰蛋白胨，5g/l 酵母提取物，10g/l NaCl，15g/l 琼脂粉，加水至 1000ml，高压灭菌；铺平板，冷却后在37培养 24小时，保存在室温。 10甘油： 10ml甘油加入90m l ddH2O水，混匀，高压灭菌。 其他： DH5大肠杆菌，灭菌玻璃平皿若干，接菌环，加100ml LB液体培养基的500ml灭菌锥形瓶一个，灭菌50ml离心管若干，冰盒，移液器，灭菌移液器吸头，灭菌Eppendorf管等。 实验仪器 酒精灯，超净工作台，温控摇床，4离心机等。 实验方法 (1) 将大肠杆菌DH5a 贮存菌液在无抗的LB平板划

4、线，37培养箱过夜培养（培养好的平皿放入4冰箱贮存备用）。(2) 从平板上挑取单菌落接种于5 mL无抗生素LB培养基中，37振荡培养过夜；。(3) 按照1:50比例接种过夜菌液至50 mL LB 培养基中，37剧烈振荡培养3小时左右，至OD600达0.3-0.6，最好是0.4 ； (4) 当OD600值达到0.4左右时，迅速将菌液冰浴1530 分钟，不时缓慢摇匀以保证内容物充分冷却。将离心管置于冰上预冷，为下一步做准备。（为获得最大效率的转化，在整个操作过程中菌液的温度不超过4是关键，以下步骤务必在超净工作台和冰上操作） (5) 将细菌培养物转移至冰冷的50mL离心管中，4用JA转头（或与之相

5、当的转头） 以2500rpm/min离心15min，以回收细胞。倒去培养液，用40mL冰冷的纯水重悬沉淀。(6) 4用JA转头（或与之相当的转头） 以2500rpm/min离心20min，以回收细胞。倒去培养液，用25mL冰冷的10%甘油重悬沉淀。（甘油有保存细胞的作用）(7) 4用JA转头（或与之相当的转头） 以2500rpm/min离心20min，以回收细胞。倒去培养液，用1mL冰冷的10%甘油重悬沉淀。（倾倒培养液时要小心，10%甘油中的细菌沉淀附着力降低。）(8) 将细胞按40L等份装入微量离心管，直接使用或-80保存(9) 感受态细胞的检测：取感受态细胞分别涂布含有氨苄青霉素和卡那霉

6、素抗性的LB平板，37培养1216小时，观察感受态细菌是否有污染； (10) 取 1 g 超螺旋质粒转化制备的感受态，检测转化效率(一般情况下，没有必要精确计算，可用根据经验估计)。 注：以上操作全部在无菌条件4冰浴下进行。 技术要点 1）无菌操作； 2）原始菌种要保证质量； 3）感受态细胞分装保存时不宜体积太大； 4）细菌活化之后，生长密度最好保证OD600为0.4-0.6； 5）冰上分装感受态细胞； 6）在80保存感受态细胞，至少半年仍然可有较好的转化效率，但也不宜过久； 7）防止携带某种质粒的其它细菌污染； 8）防止其它杂菌污染。 二. DNA连接和转化基本原理 T4DNA连接酶最初分离

7、于T4噬菌体感染的大肠杆菌，可催化 DNA 5磷酸基与3 羟基之间形成磷酸二酯键。在本试验中，将克隆载体pGEM-T 与外源DNA片段用T4连接酶连接，可将外源DNA片段插入pGEM-T 质粒中，构建外源DNA的克隆载体。 质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于 DNA 等大分子进入。同时 DNA 在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。实验材料 质粒DNA，

8、pGEM-T载体或PET表达载体，T4DNA连接酶，连接酶缓冲液 10buffer或2快速连接缓冲液，灭菌纯净水，感受态细菌，LB液体培养基10m l ，含有抗生素的LB琼脂平板培养基3个，低温冰盒，微量移液器，Eppendorf 管，一次性手套、涂菌棒等。 实验仪器 恒温水浴，温控摇床，台式离心机，37细菌培养箱等。 实验方法 建立连接反应（1）准备经过酶切处理的外源DNA片段和质粒载体；连接前先电泳确定待连接载体与片段的浓度（2）配制连接反应体系（10l反应体系） 10连接Buffer 1l（或2快速连接Buffer 5l）T4连接酶 1l待连接的样品 xl（PCR产物或胶回收产物，载体与

9、片段的mol比为13-10）载体 8- x l or 4- x l（3）混匀样品并短暂离心使样品全部沉于管底。（4）将离心管置于连接酶要求的温度孵育适当的时间，一般为16，反应 1216 小时。或4连接过夜16h以上（根据不同公司的酶的要求而定）。电转化法制备大肠杆菌感受态细胞（1）从-80中取40l感受态细胞于冰浴上融化510min，并将电转化杯冰浴。(2) 加入0.11L纯质粒或25L连接产物，轻轻吹打混匀，用移液器轻轻吸打均匀，置冰上。(3) 将要转化的混合物加入预冷的 1 mm 的电转化杯中，电转化仪选择 1800V 作为输出电压，立即按下按纽电击。(4) 将电击后的转化细胞加入800

10、LSOC培养基中，于37恒温摇床上200rpm1h温育。(5) 将菌液4000rpm/min离心3min，留200L上清将菌体打散，均匀涂布于含适当抗生素的琼脂平板表面（根据质粒所携带抗生素抗性基因而定），平板于37倒置培养过夜。i. 注：新倒的平板可于37培养箱中预先放置数小时至过夜干燥，放在4冰箱中的培养基可以先拿出来放置，让其温度升到室温。ii. 当转化的是TA克隆连接产物时可在固体培养基上加入4L 1M IPTG 和40L l20mg/mlX-gal以进行蓝白斑筛选。三、重组基因的检测基本原理质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取

11、是最常用、最基本的实验技术。质粒的提取方法很多，大多包括 3 个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒 DNA 的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程，检测重组基因是否转化成功。在含质粒的大肠杆菌混悬液中加入SDS 和NaOH 使菌体充分裂解，并使蛋白质和染色体DNA变性，加醋酸钠中和变性蛋白，染色体 DNA及SDS 沉淀，质粒 DNA存于上清中，然后用乙醇进一步纯化质粒。实验材料1 ）大肠杆菌DH-5或BL212 ）溶液I：50mM 葡萄糖；10mM EDTA ；25mM Tris-HCl ，pH8.0。（Tris：三羟甲基氨基甲烷）。 3 ）溶液II：0.2M NaO

12、H; 1%SDS, PH12.5 。 4 ）溶液III：3M NaAC；2M 乙酸，pH4.8（盐酸调 pH）。 5 ）TE缓冲液：10mM Tris-HCl，pH8.0；1mM EDTA.。 6 ）RNA酶A 溶液：10mg/ml RNA 酶 A，用TE配制，100C 煮10 分钟，灭活 DNA酶。 7 ）LB培养基：10g 胰蛋白胨，5g酵母粉，5g NaCl 加水至1000ml，用1M NaOH调pH至7.5，高压灭菌。 8 ）氨苄青霉素：用去离子水配成100mg/ml的储存液，过滤除菌，20分装保存。 9 ）LA培养基：在LB培养基中加入终浓度 100g/ml 的氨苄青霉素。 10）7

13、0% 乙醇实验仪器超净工作台，台式离心机，电泳仪实验方法1. 取1.5ml细菌培养物于已灭菌的EP管中，12000rpm离心1分钟，弃上清液，使细菌沉淀尽量干燥；2. 将细菌沉淀重悬于用冰预冷的100l 溶液I(50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA pH8.0，25mmol/LTris-HCl pH8.0)中，剧烈振荡；3. 加入200l 新配制的溶液II(0.2mol/LNaOH，1SDS（m/v）)，盖紧EP管口，快速颠倒离心管5次，以混合混合物，确保离心管的整个内表面与溶液II接触，不要涡旋，置于冰浴中；4. 加入150l预冷溶液III(每100ml的溶液III中含60ml

14、5mol/L乙酸钾，11.5ml冰乙酸，28.5mL H2O)，盖紧EP管口，反复颠倒数次，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上35分钟；5. 在最大转速下离心5min，取上清液于另一新EP管；6. 用两倍体积的乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合于室温放置2分钟，最大转速离心5分钟；7. 小心吸去上清液，将离心管倒置于滤纸上，以使所有液体都流出，在将附于管壁的液滴除尽；8. 加1ml70乙醇洗涤沉淀，振荡混合，用12,000g离心2分钟，弃上清，将开口的EP管置于室温使乙醇挥发，直至EP管中内没有可见的液体存在（510分钟），用适量的TE或ddH2O溶解；9. 用0.5l的

15、RNase 37 温育510分钟；10.电泳鉴定。技术要点 1 ）每一步都要充分混匀，为获得高产量 DNA，第一步需使菌体完全重悬。 2 ）加入碱溶液后，反复混匀使细菌充分裂解，但需要轻柔，一旦裂解（液体变清亮）必须马上加乙酸缓冲液中和。 3 ）70 % 乙醇洗涤时，离心后应小心地将上清倒掉，注意这时 DNA沉淀较疏松，易从管壁上脱落。四、质粒DNA 的琼脂糖凝胶电泳基本原理DNA在琼脂糖凝胶介质中，在电场作用下，从负极向正极移动，泳动速度取决于DNA的大小和构型，电泳后经Gel-red染色，DNA可与其结合，在紫外光下发出荧光，DNA的琼脂糖凝胶电泳可用于DNA的鉴定，定量及纯化。2 材料、

16、仪器 1 ）TAE 电泳缓冲液 浓储存液 50：242g Tris 碱；57.1ml 冰乙酸,100ml 0.5mol/L EDTA(PH8.0) 使用液 1：0.04 mol/L Tris- 乙酸;0.001 mol/L EDTA 2 ）GEBS 样本液 6 缓冲液: 15% 聚蔗糖（Ficoll）（400 型，Pharmacia）0.25% 溴酚蓝 3 ）溴化乙锭 配成10m g/ml 溶液，双蒸水配制，避光保存，用时 1 ：20000 稀释。溴化乙锭为致癌剂，配制时防止皮肤接触。 4 ）仪器 DYY-III型稳压稳流电泳仪、水平电泳槽、微波炉、离心机，北京六一厂生产。 凝胶成像系统，上海

17、Ta non 生物技术公司。 3 方法 1 ）0.8%琼脂凝胶板的配制：取 0.6g 琼脂糖加80ml TAE（1 ），20ml水，微波炉加热融化3 分钟，将其冷却至55C-65 C ，倒入制胶槽中。 2 ）充分凝固后从制胶槽中卸下凝胶板，放入电泳槽，加入 TAE （1 ），使其液面略高于琼脂糖板，拨出样品梳。 3 ）DNA样品10l 加5 l GEBS 样本液，在腊面纸上混匀，全部加样于琼脂糖板的样品孔中。 4 ）稳压电泳80V 约2 小时，使溴酚蓝指示剂泳动至适当位置，1-5V/cm 。 5 ）取出凝胶板置溴化乙锭溶液中染色20 分钟。 6 ）在凝胶成像仪观察结果。 7 ）琼脂糖凝胶与聚丙

18、烯酰胺凝胶的比较： 不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp-50kb 的DNA。聚丙烯酰胺凝胶分离小片段DNA（5-500bp）效果最好。聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶相比有三个主要优点： 基因分子生物学实验指导 （1 ）分辨力强，长度仅相差 0.2%（即 500bp 中的 1bp）的DNA分子即可分开； （2 ）装载DNA量大，一个样品槽可装载1 0ug 的DNA； （3 ）从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高。 4技术要点 1）选择琼脂糖凝胶浓度取决于所鉴定DNA的大小，小片段DNA应用高浓度凝胶，大片段则用低浓度凝胶，在1%的琼脂糖凝胶中溴酚蓝的泳动速度与500bp的双链线状DNA一

19、致。 不同浓度琼脂糖凝胶及其可分离的线性DNA大小范围见下表1。 表1 不同浓度琼脂糖凝胶及其分离线性 无抗生素LB琼脂糖平板培养基（根据需要确定配制的量）： 10g/l 胰蛋白胨，5g/l 酵母提取物，10g/l NaCl，15g/l 琼脂粉，加水至 1000ml，高压灭菌；铺平板，冷却后在37培养 24小时，保存在室温。 含有抗生素LB琼脂糖平板培养基（根据需要确定配制的量）： 10g/l 胰蛋白胨，5g/l 酵母提取物，10g/l NaCl，15g/l 琼脂粉，加水至 1000ml，高压灭菌；当培养基降温至50左右，加入终浓度为 100g/ml 的氨苄青霉素或 50g/ml 卡那霉素，并铺平板，冷却后在37培养 24小时，保存在室温。