本科毕业论文正交试验法优化复方枳实厚朴汤的提取工艺设计.docx
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本科毕业论文正交试验法优化复方枳实厚朴汤的提取工艺设计
毕业论文
论文题目：
正交试验法优化复方枳实厚朴汤的提取工艺
目录
一、论文
1、标题和作者…………………………………………2
2、中文摘要及关键词…………………………………2
3、英文摘要及关键词…………………………………2
4、前言…………………………………………………2
5、正文…………………………………………………3
6、讨论…………………………………………………6
7、参考文献……………………………………………7
8、文献综述……………………………………………8
9、致谢及声明…………………………………………11
二、导师评阅意见表
三、实习总结
枳实厚朴汤中枳实的提取工艺研究
潘晓微（江西中医学院）关志宇（江西中医学院药学院）
中文摘要
目的：
研究复方枳实厚朴汤的最佳提取工艺。
方法：
采用L
正交试验，用总黄酮的含量为指标，考查提取时间，提取次数，加水量对提取结果的影响。
结果:
枳实厚朴汤的最佳提取工艺为在10倍加水量，90min的提取时间下提取两次。
结论：
采取正交设计筛选出的该工艺，方法较好，操作简单、重现性好、有效成分提取率高、工艺可行。
关键词：
枳实提取工艺正交试验总黄酮
ABSTRACT
Purpose:
Studytheeffectofcompoundfrutusaurantiimagnoliaofficinalissoup.ThebestextractiontechnologyMethods:
Withorthogonalexperiment,byL
flavonoidscontentastheindex,examinesextractiontime,extractiontimes,wateraddedtoaffecttheresultsofextracted.Results:
Frutusaurantiimagnoliabarkthebestextractiontechnologyforsoupin10insteadofwater,90minextractingtimenextextractiontwiceConclusion:
Takeorthogonaldesignmethodofthisprocess,weregood,simpleoperation,goodreproductivity,extractiontechnology,higheffectivecomponentsfeasible.
Keyword
immaturebitterorange；Extractiontechnology；Orthogonaltest；flavonoid
前言
枳实厚朴汤，处方来源《家塾方》是由枳实、厚朴等药材组成的复方汤剂，方中用枳实“能消心下痞塞之痰，泻腹中滞塞之气，推胃中隔宿之食，消腹内连年之积”，为脾胃胀痛之主药，与苍白术合用理气导滞，消补兼施，以助其升清降浊之枢机，厚朴，行气消积，加强枳实消胀除满之力，该药方主治虚滑泻痢，久不愈者【1】。
为了更好地发挥枳实厚朴汤的药效，本文以总黄酮的含量为指标，采用正交试验法对该汤剂的提取工艺进行优选，从而确定最佳提取条件。
正文
1.试验材料
1.1试验药材麸炒枳实，购自江西樟树天齐堂中药饮片有限公司。
厚朴，购自江西汇仁药业有限公司。
1.2试验试剂甲醇（上海振兴化工厂，批号20101120）为分析纯，水为重蒸水。
1.3仪器设备752型可见分光光度计（上海欣茂仪器有限公司），SHZ-D（III）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司），数显恒温水浴锅HH-4（国华电器有限公司）、KQS200DA型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、真空干燥箱-D2（上海一恒科学仪器有限公司）、RE-52D旋转蒸发器（上海青浦沪西仪器厂），ZNHW智能恒温电热套（巩义市予华仪器有限责任公司）、BP.II型马头牌架盘药物天平（上海医用激光仪器厂）
2.提取工艺优选
2.1正交试验
采用恒温水浴提取法提取复方中药，温度设置在100℃，选择加水量（A）、提取时间（B）、提取次数（C）3个指标作为考察因素，每个因素选取3水平，因素水平详见表1。
选择L9（34）正交表进行试验，每次取药材46.5g进行提取，后在水浴锅上浓缩至浸膏状，再放入干燥箱中干燥，称重，备用。
表1因素水平表
Tab1Levelsoffactors
水平
因素
加水量（倍）提取时间（min）提取次数（次）
（A）（B）（C）
1
2
3
6301
8602
10903
2.2枳实中总黄酮的含量测定
根据文献【2】,采用紫外分光光度法测定枳实总黄酮含量。
而柚皮苷紫外最大吸收峰与总黄酮相同,分别在283nm处产生最大吸收,且柚皮苷可自中国药品生物制品检定所购买,因此,使用柚皮苷作为总黄酮测定的对照品。
2.2.1对照品溶液的配制精密称取柚皮苷对照品5.28mg，置50ml量瓶中,甲醇定容至刻度,作为对照品溶液。
2.2.2标准曲线的绘制精密吸取对照品溶液0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0ml于10ml量瓶中,甲醇定容至刻度,以甲醇为空白,在283nm处测吸收度。
得回归方程为:
A=0.027C-0.001,r=0.9999。
线性范围为5.28～31.68μg·ml-1[3]
2.2.3供试品溶液的制备将正交工艺所得的干浸膏,分别精密称取约50mg置25ml容量瓶中,加甲醇定容至刻度,超声15min后冷却至室温,加甲醇至刻度,摇匀,过滤,精密吸取续滤液5ml置100ml容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,得供试品溶液【3】。
2.2.4精密度试验取标准对照液2.0mL，照2.2.3方法制备标准品供试液和空白对照液在283nm波长处重复测定5次，其结果RSD为1.04%，表明仪器精密度符合要求。
2.2.5重现性试验取同一供试品样品5份，每份3g，精密称定，按“供试品溶液的制备”项下的方法制备样品溶液，再按“对照品溶液的制备”项下的方法重复操作，计算总皂苷的含量。
结果总黄酮的平均含量为9.73%，RSD=3.95%（n=5）。
由于RSD<5%，表明方法的重复性较好。
2.2.6样品含量测定分别将9种工艺下的供试品在紫外分光光度计中进行测定，得到各供试品的吸光度，从而计算出总黄酮的含量（mg/ml）,结果见表2
表2正交试验表
Tab2Resultsoforthogonalexperiment
试验号
因素
总黄酮含量
A
B
C
D
1
1
1
1
1
1.78
2
1
2
2
2
1.99
3
1
3
3
3
2.72
4
2
1
2
3
3.29
5
2
2
3
1
3.14
6
2
3
1
2
4.00
7
3
1
3
2
4.16
8
3
2
1
3
4.77
9
3
3
2
1
5.04
K1
6.49
9.23
10.32
9.96
K2
10.43
9.90
10.55
10.15
K3
13.97
11.76
10.02
10.78
SS
9.334
0.444
0.159
0.047
R
2.49
0.45
0.18
0.27
2.4结果分析
2.4.1直观分析采用中药传统的水煎煮提取枳实厚朴汤，以总黄酮的含量为指标，对影响枳实提取工艺的因素进行了分析。
通过比较各因素的极差值（R）可以看出，各因素对该指标影响大小的排列顺序为A>B>C，再考查因素之间各水平之间的差异，发现最佳提取工艺为A3、B3、C2，即10倍加水量，90min提取时间的条件下提取二次。
2.4.2方差分析结果详见表3。
表3方差分析结果
Tab3Resultsofvarianceanalysis
方差来源离差平方和自由度方差F显著性
A9.33424.66775.9960.013
B0.44420.2229.3260.097
C0.15920.07950.3830.723
D0.04720.0235
表3方差分析结果表明，加水量对提取液中总黄酮含量的影响有极显著意义，提取次数和提取时间的影响较小。
通过对试验结果进行的正交分析可以确定陈皮煎煮工艺的最佳条件为A3、B3、C2，确定最佳的提取方法为A3、B3、C2，即用10倍量的水、90min的提取时间和2次得提取次数。
3验证试验
以正交试验的最佳提取条件进行验证试验，经过三次平行试验，由结果可知，应用优化后试验条件进行提取，提取率较高，重复性较好。
4讨论
尽管有研究[4]表明醇提枳实药材优于水提，但考虑到实验成本以及煎煮药材的便利性，本文最终还是选取了以水为溶剂的正交试验。
在本次实验中，作者以枳实中的总黄酮为指标，通过对实验结果进行的正交分析可以确定该复方煎煮工艺的最佳条件为用10倍加水量，90min提取时间的条件下提取二次，且验证试验也表明该工艺合理、稳定、提取率高，为实际生产提供了理论依据，同时本研究结果也对开发利用枳实资源具有一定的意义。
参考文献：
[1]秦立伟，刘桂英.枳实厚朴汤治疗功能性消化不良65例[J].光明中医，2011，26
（1）：
73-74
[2]韦黄杰，舒斌，陈玉俊，等.分光光度法测定化橘红总黄酮含量[J].中成药，2005，27（3）：
354
[3]刘文娟，耿秋菊，蔡蓉.枳实药材中总黄酮提取工艺的研究[J].时珍国医国药，17（11）：
2233-2235
[4]王 淳,刘振丽，宋志前，李林福，吕署一，郝兴辉.中药枳实提取工艺研究[J].中国实验方剂学杂志，14（9）23-25
文献综述
枳实综述
摘要:
枳实是临床消化科常用中药，且疗效显著，现对其基本信息，药性，药理作用，理化鉴别，提取等方面做如下综述。
关键字：
枳实药理作用提取工艺含量测定
枳实为芸香科植物酸橙及其栽培变种或甜橙的干燥幼果，主产于四川、江西、福建、江苏等地。
5～6月间采摘或采集自落的果实，自中部横切为两半，晒干或低温干燥，较小者直接晒干或低温干燥。
用时洗净、闷透，切薄片，干燥。
生用或麸炒用。
《药品化义》：
“枳实专泄胃实，开导坚结，故主中脘以治血分，疗脐腹间实满，消痰癖，祛停水，逐宿食，破结胸，通便闭，非此不能也。
若皮肤作痒，因积血滞于中，不能营养肌表，若饮食不思，因脾郁结不能运化，皆取其辛散苦泻之力也。
为血分中之气药，惟此称最。
”
1.基本信息
枳实[1]又名鹅眼枳实，英文名是ImmatureBitterOrange、ImmatureSweetOrangeFructusAurantiiImmaturus拉丁名是.CitrusaurantiumL.或者Citrussinensis（L.）Osbeck，一般以植物的幼果入药。
按功效分类属于理气药，消食药，性苦、辛、寒，归脾、胃、肝心经，功效主治有积滞内停、痞满胀痛、大便秘结、泻痢后重、结胸、胃下垂、子宫脱垂脱肛。
用法用量有①内服：
水煎，3-10g；或入丸、散。
②外用：
适量，研末调涂；或炒热熨[2]。
2.药理作用
2.1对心血管系统的作用枳实对心血管的药理作用早在上世纪就有报道，例如其显著的升压效应，类似于去甲肾上素，且持续时间长，增强收肌收缩力，减缓心率和增加心血输出量，增大冠脉流量。
增大肾血流量，改善末梢微循环等。
这些药理作用已经广泛应用于临床。
现代研究又发现枳实可浓度依赖性地增加家兔主动脉张力，使主动脉平滑肌收缩。
酚妥拉明、异搏定、无钙Krebs液均可明显减小枳实的作用，此作用可能与激活平滑肌细胞膜上的肾上腺素能α受体、胆碱能M受体及异搏定Ca2+敏感通道有关，并对脑外存在一定的依赖性，与平滑肌细胞膜上组胺H1受体无关[3]。
2.2对胃肠平滑肌的作用枳实能显著提高食极小鼠的酚红排空率，改善食积小鼠胃肠活动功能减弱的状态[4]。
枳实能使大鼠消化间期移行性复合运动MMC活动时相延长，即增加周期内的峰电位数增加，并能使绵羊小肠电活动增强,减短MMCII相时程，提高III相的发生机率和峰电强度[5]，因平滑肌的收缩强度和收缩持续时间与峰电位发放的频率多少有关，故能增强平滑肌的收缩强度和收缩持续时间[6]。
对于IDMEC（小肠消化间期综合肌电），枳实可使其周期和I相时程缩短，II相时程延长，峰电位数增加，从而加强小肠运动[7]。
无论是使IDMEC的峰电位增高还是使MMC活动相时程延长，均能使平滑肌收缩加强，从而对消化起到一定的促进作用。
2.3对子宫的作用药理研究证实枳实能使家兔子宫收缩有力，张力增强，收缩节律增强，但对小鼠的离体子宫则主要表现为抑制作用，枳实水提醇沉物能兴奋离体家兔环行阴道平滑肌，并能诱发肌条的节律性收缩活动或增强原有自发性收缩肌条的收缩力及收缩频率[8]。
2.4对血液流变学的影响枳实对健康大鼠及血癌模型大鼠均存在明显的抗血小板聚集及抑制红细胞聚集的作用，其作用优于阿司匹林，并呈明显的量效关系。
枳实活血化瘀作用可能是通过对血小板聚集、红细胞聚集的抑制作用达到的，枳实有望作为一种有效的血小板聚集抑制剂在临床中应用[9]。
2.5镇痛作用枳实的挥发油不但能够对胃肠平滑肌产生效应，还能够对大鼠离体肠平滑肌的收缩呈先兴奋后抑制得作用，而且可明显减少醋酸引起的小鼠扭体反应次数及自发活动次数，并表现出了一定程度的镇痛和中枢抑制作用[10]。
2.6抗菌作用 枳实挥发油对耐药金葡萄球菌存在抑制作用，柠檬烯则有镇咳、祛痰、抗菌的作用;芳樟醇则有防腐抗菌、抗病毒、镇静的作用[11]。
2.7抗氧化作用研究表明枳实提取物能够有效地清除羟自由基、超氧阴离子自由基、DP-PH自由基，还具有抑制脂质过氧化作用，具有进一步研究和开发的价值[12]。
2.8护肝和降血糖作用 枳实提取物治疗组与糖尿病模型组比较，血糖水平明显降低，谷胱甘肽含量显著增加，谷胱甘肽过氧化物酶活性、丙二醛和NO含量显著减小。
超过氧化物歧化酶活性有所增强。
光镜下枳实提取物治疗组肝组织细胞损伤较糖尿病组降低，显示具有增强肝脏的抗氧化的能力，降低肝细胞损伤的作用，同时高剂量时能显著降低血糖[13]。
2.9抗休克作用低浓度枳实提取液，使豚鼠心室肌细胞L型钙电流浓度依赖性地增强，对钙通道具有促进开放的作用。
高浓度枳实提取液，可对心室肌细胞L型钙电流具有抑制作用，并有抑制钙通道开放的作用，临床应用枳实提取液用于治疗各种休克，包括急性心肌梗塞心源性休克、感染性休克等均获得较好的疗效[14]。
2.10其他作用枳实还具有抗溃疡作用、利胆作用、利尿作用、抗过敏作用等。
2．化学成分
枳实所含化学成分较为复杂，主要含有3种类型的有效成分：
①生物碱类成分:
上世纪70年代我国学者从枳实中分离得到两种子选有升压作用的有机碱辛费林和N甲基酪胺[15]。
②黄酮苷类:
主要在橙皮苷、新橙皮苷和柚皮苷桔蜜黄素,3,5,6,7,8,2,3,4甲氧基黄酮等[16]。
③挥发油成分枳实挥发油成分以萜类经合物中的单萜为主，分别是柠檬烯、芳樟醇、异松香烯等[17]，主要为柠檬烯[18]。
此外，枳实中还含有内酯类成分，为柠檬苦素此外，枳实中还含有内酯类成分，为柠檬苦素。
有机酸类成分主要为柠檬酸酸和苹果酸，并含根皮酸β-D葡萄糖苷、糖类、维生素、钙、磷、铁等。
国内外对枳实类药材的化学成分定量研究主要集中在辛弗林和N药材的化学成发定量研究主要集中在辛弗林和N甲基酪受酸、橙皮苷、总黄酮含量及挥发油的测定[19]。
3.提取工艺
3.1挥发油的提取
方法1取2kg枳实粗粉，加入蒸馏器中,以水浸泡后，直接加热蒸馏，直到无油馏出，停止蒸馏，冷却，分层，收集油层将油相脱胶，脱色后得到淡黄色挥发油29g。
方法2将枳实粗粉置于有孔隔层板网上，加热底部的水产生蒸汽，挥发油随水蒸气蒸馏出。
挥发油是一类具有芳香气味的油状液体，主要有萜类化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物组成，常呈无色或淡黄色液体，不溶于水，可随水蒸气而蒸馏出[19]。
3.2果胶的提取
提取挥发油后的渣以热水提取，果胶、辛弗林、柚皮苷、新橙皮苷溶于热水而被提取出。
考察了水的用量、提取时间、提取温度对4种成分提取得率的影响,可知20倍量（V/m）的水在90℃下提取15h,4种成分可最大限度地被提取出。
水液调pH=2后以732型阳离子交换树脂吸附，用水洗脱出不被树脂吸附的果胶、柚皮苷、新橙皮苷，而辛弗林成盐后形成阳离子被树脂吸附从而达到分离，水洗脱液浓缩，醇沉，将柚皮苷、新橙皮苷溶于醇液而沉淀出果胶。
果胶分离中主要考察浓缩液的密度、醇的浓度及醇的用量。
分别取50g枳实渣以正交试验进行考察，可知最佳工艺:
水液质量浓度16g/mL，醇沉质量分数80%，乙醇用量20倍（V/m）。
粗果胶以水热溶后加入5%活性炭在80℃下保温30min，趁热过滤，滤液浓缩至干，真空干燥粉碎得白色胶粉，称重76g，测得含量为93%质量分数[20]。
3.3柚皮苷的提取
3.2中的醇液中含有柚皮苷和新橙皮苷。
醇液浓缩回收乙醇得浸膏，利用柚皮苷和新橙皮苷在不同酸度下的溶解性差异将2者分离。
将50g枳实渣的醇浸膏以澄清石灰水溶解、过滤,滤液以梯度酸沉淀将其分离，鞣质类成分与钙离子螯合。
主要考察了石灰水的碱度、用量及剩余残渣的量。
残渣的量不变说明浸膏中能被碱水溶出的成分已全部溶出,因此以残渣的量研究石灰水溶解的最佳工艺，以pH=14的澄清石灰水8倍量（V/m）溶解可很好地溶解有效成分而去除杂质。
得到的淡黄色结晶物过滤，固形物以热乙醇溶解后，加入少量活性炭在60℃保温30min，趁热过滤，滤液澄清透明，减压浓缩至小体积，结晶,得类白色结晶26g，测其含量为98.6%[21]。
3.4新橙皮苷提取
将上一步中的沉淀出柚皮苷的液体再次调酸碱度，析出黄色新橙皮苷，结晶物以乙醇溶解，加入少量活性炭，在60℃保温30min后趁热过滤，滤液浓压浓缩至适当体积，静置析出类白色结晶新橙皮苷为白色针状晶体由稀乙醇或稀醋酸结晶，熔点236～237℃，加2%盐酸或硫酸水解产生桔皮素。
新橙皮苷也属于黄酮类化合物,在橙皮苷的提取中也随之提出,但与柚皮苷性质相似，调酸后游离但无沉淀析出，可能是因为含量较低的缘故[22]。
3.5辛弗林的提取
3.2中的以732型强酸性阳离子树脂吸附辛弗林，以氨水洗脱，薄层色谱TLC检查，直至无辛弗林洗出时为止，将含辛弗林的成分浓缩、结晶、重结晶,得白色晶物0.25g,含量98.4%。
辛弗林属麻黄碱类，易溶于酸水中，因此在果胶的提取中与果胶同时提出，由于分子结构中存在酚羟基和氨基，具有两性，可与碱成盐，而游离的辛弗林不溶于水，易溶于有机溶剂，成盐后则易溶于水而难溶于有机溶剂，在离子交换树脂层析时易发生消旋。
在辛弗林的提取中也可以分离出鲸鱼胺生物碱[23]。
3.6橙皮苷的提取
枳实水提后的渣干燥后分别取50g以饱和石灰水提取过滤提取液以10%盐酸调至酸性后沉淀，过滤沉淀物，水洗至中性再将沉淀物溶于氢氧化钙液中，加热、保温、调酸性、搅拌、保温、降温至室温、过滤,滤饼以水洗至中性，烘干得橙皮苷。
以T型关联度分析法考察了碱水的pH、酸化pH、沉淀温度、沉淀时间等因素的影响，结果显示影响得率的最大因素为石灰水的碱度，影响含量的最大因素为沉淀时的温度，得到最佳工艺为:
饱和澄清石灰水提取，提取液调pH=4,60℃下沉淀20h。
在此工艺下橙皮苷得率25.2%，含量质量分数为96.4%[24]。
3.7柠檬苦素的提取
以碱液提取橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷后的渣晾干，以等量（V/m）丙酮在60℃下回流提取2次，滤液合并浓缩再以二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷液，浓缩、析晶，将晶状物热溶于丙酮，加入少量活性炭，保温30min，趁热过滤，滤液浓缩并静置结晶,得白色结晶物[25]。
3.8．枳实黄酮的提取
3.7中的渣含有枳实黄酮，以乙醇提取，提取液回收乙醇后喷雾干燥。
以均匀设计法考察了乙醇浓度、乙醇用量、提取温度、提取时间对枳实黄酮得率的影响，结果表明乙醇浓度、提取温度、乙醇用量对提取影响均很大，考虑到实际操作，可将最优条件定为乙醇体积分数为80%，料液比15：
1（V/m），提取温度70℃，提取时间15h，该工艺下枳实黄酮得率10.8%[26]。
3.9．枳实高蛋白饲料
3.8中的枳实渣可制备高蛋白饲料，枳实渣含丰富的碳水化合物、维生素、矿物质、氨基酸，但蛋白质含量不高，经发酵后可产出高蛋白饲料[27]。
4．鉴别
（1）取本品粉末0.5g，加甲醇10ml，加热回流10分钟，滤过，取滤液1ml，加四氢硼钾约5mg摇匀，加盐酸数滴，溶液显樱红色至紫红色（检查二氢黄酮类成分）[2]。
（2）薄层色谱取样品粉末0.5g，加甲醇10ml，回流1小时，滤过。
滤液蒸干，残渣加甲醇4ml溶解，放置30分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。
取辛弗林（对辛福林）加甲醇溶解，制成每1ml含3mg的对照品溶液。
分别点于硅胶H-CMC板上，以甲醇－丙酮-氯仿-浓氨水（3:
3:
3:
1）展开15cm，取出,，晾干，喷以0.5%茚三酮乙醇溶液。
于105℃加热约10分钟，供试品色谱在与对照品色谱相应的位置上,显相同的紫色斑点[2]。
5．成分含量测定
5.1.辛弗林、N甲基酪胺等生物碱的含量测定
5.1.1辛弗林的甲醇溶液经紫外扫描确定在275nm有最大吸收，故选择UV275nm为检测波长。
采用HPLC的方法对枳实中辛弗林的含量进行测定。
5.1.2在测定不同批次的枳实药材中，发现辛弗林含量波动较大，易导致该制剂含量差异较大，因此须控制药材质量采用HPLC法测定枳实药材中辛弗林的含量，方法快速准确，样品处理简便易行，可用于该制剂的质量控制。
5.1.3药典上记载有用薄层色谱法测定辛弗林的含量。
5.2.橙皮柑、柚皮柑等的含量测定
5.2.1采用HPLC法测定枳实中黄酮类成分橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷和芸香柚皮苷等4种指标成分的含量。
在等度洗脱的条件下,用反相HPLC测定不同产地枳实橙皮甙和柚皮甙的含量,方法具有简单快速、精密度高、结果准确等优点,且样品经提取、浓缩、定容后不需要进一步的纯化。
5.2.2采用薄层色谱法测定橙皮苷、柚皮苷的含量也比较常见
5.2.3毛细管电泳法也能够快速测定橙皮苷、柚皮苷成分的含量。
5.2.4采用分光光度法测定橙皮苷的含量仪器采用751G分光光度计，先制备标准曲线，精密称取橙皮苷对照品适量，加70％乙醇溶液制成每毫升含橙皮苷0.0536mg的对照品溶液。
精密吸取2、4、6、8ml量瓶中，加1mol/L氢氧化钠乙醇液0.1ml，加醇液至刻度，摇匀、放置30min。
用同样方法处理溶剂做空白对照，在分光光度计上，于362±2nm处测定吸光度，以吸光度，以吸光度为纵坐标，样品坐标为横坐标作图，橙皮苷浓度在0.05～0.4mg/ml范围内呈线性关系，计算，回归方程为：
Y＝1.573X－4.72×10-3，r＝0.9999然后开始样品测定，
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