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诺如病毒标本处理和室检测技术方案

附件4

诺如病毒标本处理和实验室检测技术方案

诺如病毒完整检测及分型流程包括标本前处理、RNA提取、Real-timeRT-PCR检测、传统RT-PCR检测、测序和基因分型6个步骤。

Real-timeRT-PCR方法灵敏度和准确度高，是检测诺如病毒金标准。

用传统RT-PCR可对Real-timeRT-PCR阳性标本PCR产物进行测序，通过序列分析确定诺如病毒基因群和基因型。

在发生聚集或暴发时，ELISA方法可作为辅助手段快速检测诺如病毒抗原。

食品、水、环境涂抹样检测方法灵敏度不稳定，仅作为参考方法。

一、标本前处理

1.粪便、呕吐物

1.1设备和材料

微量移液器、无菌过滤器、漩涡振荡器、微量离心机、1.5ml无菌离心管、10mMpH值为7.0－7.4PBS。

1.2操作方法

（1）离心管每管分装0.5mlPBS。

用一次性移液管（或无菌棒）添加豌豆大小粪便（约0.1g），稀释成约10％至20％（重量/体积）粪便悬浮液。

当粪便样品是液态时，不必在PBS中稀释，直接使用500µl样品。

（2）漩涡振荡每个样品1min。

在2400g下离心5min，使得固体沉淀。

澄清上清液可以直接用于病毒核酸提取或贮存于－70℃。

（3）取澄清上清液200µl进行RNA提取。

2.水

通过阴离子滤膜过滤水样品。

用牛肉膏（1.5%w/v）含0.05M甘氨酸（pH9.0）缓冲液洗脱附在膜上病毒。

使用Microsep100TM或CentriconTMcolumns离心管进一步浓缩洗脱液。

2.1设备和材料

DEPC水、新配置次氯酸盐（至少1%）或等效消毒剂、MilliporeHAfilter（孔径0.45um、）、换膜过滤器、真空泵、计时器、PH值酸度计、磁力搅拌器及转子、低温冰箱（-20℃、-70℃）、Microsep100Kcolumns（PALL公司）、CentriprepYM-50（Millipore公司）、洗脱液（BE-0.05GlypH7.0）、PBS（pH7.2）、离心机、氯仿、丁醇。

2.2操作方法

2.2.1过滤装置准备

（1）使用无菌镊子将滤膜放在滤器架上，滤膜有3层，型号分别为MilliporeHAfilter、AP15和AP20，放置顺序为MilliporeHAfilter→AP15→AP20。

注意：

暴露出滤膜表面使其能和水样接触，请将滤膜光滑表面那边向下。

所有玻璃器皿应干净无菌。

每批水样使用不同漏斗。

（2）将滤膜置中，将有刻度漏斗放在滤器上边。

（3）使用不锈钢滤器夹进行水密封。

（4）真空泵连接1000ml锥形瓶。

注意：

为防止气溶胶污染，应在无菌环境中过滤，在生物安全柜进行操作。

（5）向滤器中倒入20ml无菌水（DEPC水）检查滤膜密封情况。

（6）打开泵，调整水流速至形成缓慢细流。

2.2.2水样品过滤

（1）向玻璃漏斗里倒水样，当水样完全滤过立刻关闭真空泵。

（2）用不锈钢滤器夹，小心移开滤膜上刻度漏斗。

2.2.3用酸漂洗滤膜

将膜用无菌镊子夹放在有200ml0.05mMH2SO4（pH3.0）无菌500ml烧杯中进行漂洗滤膜去除Mg2+。

2.2.4洗脱

（1）将膜夹出放在无菌60mm培养皿中，加5ml洗脱液。

盖上铝箔。

注意：

要将滤膜上边向下（倒置）放在锥形瓶里。

（2）将锥形瓶放在恒温摇床上，转速0.01g（45rpm），室温（23℃±3℃），15min。

（3）关闭摇床，将洗脱液（大约5ml）转移到管子里。

2.2.5中和洗脱液

用1NHCl或1NNaOH调整洗脱液pH到7.0－7.4。

检测前，洗脱液在－70℃储藏。

2.2.6二次浓缩

方法一：

用Microsep100Kcolumns或CentriprepYM-50浓缩病毒

（1）为防止病毒附着，先用无病毒粒子洗脱液浸湿过滤器。

（2）将水标本滤膜洗脱液（大约5ml）加入到浓缩柱中，2400g离心5min。

（3）吸取浓缩液（约150µl），转移至1.5ml离心管中。

方法二：

PEG沉淀

（1）向标本洗脱液中加入NaCl终浓度是0.3mol/L（若洗脱液为5ml加0.08775gNaCl）,有助于病毒沉淀，再等量加入PEG-6000终浓度为12.5％（w/v）（若洗脱液为5ml，加0.0625gPEG-6000。

4℃过夜。

（2）4℃，9600g离心30min，收集沉淀；

（3）MilliporeHAfilter，倾倒并弃掉上清液。

每个离心管添加150－500µlpH7.2（±0.2）PBS重悬沉淀物。

将离心管放置在离心管架上，为更好让缓冲液和沉淀物接触，将离心管架成一定角度放置。

室温放置30min。

注意：

如果沉淀物没有溶解，可用缓冲液反复轻轻吹打沉淀物。

吹打过力会产生气泡。

（4）向悬液中加入等体积氯仿/丁醇（1:

1vol/vol）混合。

去除病毒悬液中抑制剂。

（5）4℃，9600g，离心20min。

（6）分离出水相（上清液），－80℃储藏。

（7）取200µl上清液进行核酸提取。

3.环境涂抹样

将棉签在PBS里蘸湿，用力涂抹待测表面（最大面积100cm2）后，立即浸入核酸提取试剂盒裂解缓冲液中，将棉签用力压EP管侧壁，释放棉签中液体。

重复浸入和压侧壁步骤3~4次，确保病毒最大释放量，直接进入核酸提取步骤。

4.食品

4.1贝类

4.1.1设备和材料:

诺如病毒质控样（中国食品药品检定研究院）、高速离心机（可离心15ml~50ml体积）、台式离心机、碎花制冰机、生物安全柜、实时荧光定量PCR检测系统、眼科剪、眼科镊、一次性无菌培养皿、恒温摇床、高压灭菌器、电磨均质器（LX134MO）、一次性研磨杵（上海生工）、15ml去RNAase离心管、1.5ml去RNAaseEppendorf管、20µl、200µl、1000µl微量移液器、PBS溶液pH7.2（Gebico）、蛋白酶K（PCR级Roche）。

4.1.2贝类样品处理程序

采集贝类样品，进行解剖，剪取消化腺和肠道后均质，最后提取RNA。

4.1.3解剖方法

5个贝类个体作为一件样品，分别解剖，取其消化腺和肠道，用于检测。

如果一件样品消化腺和肠道总质量不够2.0g，应适当增加取样量，使得每件样品检验总质量达到2.0g。

（1）牡蛎解剖方法

使用灭菌刀具将牡蛎壳撬开，使用灭菌眼科剪和眼科镊，先将牡蛎内脏部分剪取下来放到一个灭菌平皿里，沿肠道将牡蛎软体部分剪开，暴露出肠道和消化腺，将多余组织去掉，取其消化腺和肠道用于检测。

牡蛎解刨过程及解剖结构见

（2）海虹

用灭菌刀具将双壳撬开，将消化腺用镊子直接夹下，同时尽量将肠道取下。

由于海虹消化腺相对牡蛎较小，所以需要增加取样海虹个体数，以使得总质量达到2.0g，用于后续检测。

（3）扇贝、毛蚶和文蛤

扇贝和毛蚶解剖结构和海虹相似，参照海虹方法将壳打开后，直接判断消化腺所处位置，用眼科镊和眼科剪，将其消化腺和肠道取下用于诺如病毒检测。

文蛤消化腺包在内脏团里，在解剖时可以直接用镊子在内脏团消化腺位置撕开，将消化腺取下，同时将肠道取出，用于检测，文蛤消化腺体积较小，需要适当增加取样量以满足检验要求。

4.1.4均质

将上述解剖下消化腺和肠道放到50ml灭菌小烧杯内，用电磨均质器（LX134MO）将消化腺仔细打碎，成糊状。

4.1.5蛋白酶K消化

将上述均质消化腺，分别称取2.0±0.1g，加入15ml离心管，然后每管加入2mlPBS溶液，加入20mg/ml蛋白酶K（Roche）溶液10µl进行消化，另外取1件样品加入诺如病毒阳性质控球，作为外部质控阳性对照。

4.1.6将上述样品于摇床37℃，0.57g（320rpm）振荡1h。

恒温水浴60℃，保持15min；将15ml离心管，3000g离心5min，取200µl用于RNA提取，剩余部分冷冻保存，用于复检。

4.2三文鱼

4.2.1设备和材料

诺如病毒质控样（中国食品药品检定研究院）、恒温振荡器、食品均值器、天平：

感量0.1g、高速低温离心机（4℃，10000g）、5×PEG8000/NaCl溶液（PEG8000500±2g，NaCl87±1g,先用450ml蒸馏水溶解，稍微加热，待溶解后定容至1000ml，121℃，15min灭菌）、磷酸盐缓冲液（PBSpH7.2）、Tris/甘氨酸/牛肉膏缓冲液（TGBE）（Trisbase12.1±0.2g,甘氨酸3.8±0.1g，牛肉膏10±1.0g，蒸馏水1000±1ml，121℃，15min灭菌）、氯仿/正丁醇（1:

1体积比）溶液。

4.2.2样品处理程序及方法

（1）取三文鱼样品25g，剪碎后置于带滤网均质袋中，加人TGBE缓冲液40ml，均质均匀，于室温60r/min震荡20min。

（2）取滤液至50ml新离心管中，4℃，10000g离心30min。

（3）取上清液（小心避开液体表面油脂层），加入上清液1/4体积5×PEG/NaCl溶液，颠倒60s，4℃，60r/min震荡60min。

（4）将上述溶液于4℃，10000g离心30min，弃去上清液。

向沉淀物中加入PBS溶液700µl，震荡重悬。

（5）加入和上述重悬液等体积氯仿/正丁醇（1:

1）溶液，充分振荡，室温孵育5min。

于4℃，10000g离心15min。

（6）取上层水相液体200µl用于提取病毒RNA。

4.3草莓、蓝莓

4.3.1设备和材料

诺如病毒质控样（中国食品药品检定研究院）、PEG8000（Polyethyleneglycol）、氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、碳酸氢钠（NaHCO3）、磷酸二氢钾（KH2PO3）、磷酸氢二钠（Na2HPO3）、NaOH溶液（5M）、HCl溶液（1M）、纯水（MilliQ系统净化）、氯仿（Methenyltrichoride）、丁醇（1-Butanol）、牛肉膏（BeefExtract）、甘氨酸（Glycine）、蛋白酶K（ProteinaseK）、果胶酶（PectinasefromAspergilusniger，Sigma）、5×PEG/NaCl缓冲液（PEG8000500±2g，NaCl87±1g,先用450ml蒸馏水溶解，稍微加热，待溶解后定容至1000ml，121℃，15min灭菌）、TGBE缓冲液（Trisbase12.1±0.2g,甘氨酸3.8±0.1g，牛肉膏10±1.0g，蒸馏水1000±1ml，121℃，15min灭菌）、DHZ-D型冷冻恒温振荡器、FE20K型酸度计、小型高速离心机、CR22E型高速冷冻离心机。

4.3.2样品处理程序及方法

（1）取样称取25g草莓（蓝莓）样本放入滤膜均质袋中，加入40mlTGBE缓冲液，（取一份样本作为阳性对照，可在这步加入诺如病毒阳性质控球），以及30单位果胶酶（PectinasefromAspergilusniger,Sigma）

（2）样品提取室温振荡孵育10min，测量pH值。

若pH<9.0，用NaOH（5M）溶液小心调节至9.5，再振荡孵育10min。

每调节一次pH值后，孵育10min，直至pH>9.0；将流出液倒至离心管中（必要情况下使用2个离心管），4℃，10000g离心30min；上清移至一新管或瓶，用HCl（1M）调节pH至7.0±0.5；

（3）样品富集浓缩加入1/4体积5×PEG/NaCl缓冲液，在4℃条件下，于振荡孵育器孵育60min；4℃，10000g离心30min（必要情况下将液体分装于2只离心管）；

弃去上层溶液，4℃，再次10000g离心5min以使颗粒紧凑；

弃去上层溶液，用500µlPBS重悬沉淀。

如果一个样品分两管离心，则用同样体积PBS依次重悬；

将重悬液移至新EP管中，加入等体积氯仿/丁醇溶液，涡旋混匀，室温孵育5min。

4℃，10000g离心15min，小心将水相转移至新管待提取RNA。

4.4生菜和苗芽菜

4.4.1设备和材料

食品均质器（可拆卸、可清洗、可高压灭菌）、电子天平（感量0.01g）、台式离心机（最高转速15000g）、微型离心机、电热恒温水浴锅（0-100℃）、涡旋振荡器、实时荧光PCR仪、Roche，LightCycler480。

4.4.2样品处理程序及方法

（1）同一批次生菜或苗芽菜样品，随机抽取样品数不少于5件，并用灭菌处理剪刀剪碎至2.5cm×2.5cm×2.5cm大小形状，称量25g放入带有滤膜均质袋一侧中，作为待试样品。

另称取200g样品放入50ml离心管中，－80℃保存，留作备样，并做好标记。

（2）向上述均质袋中加入40mlTGBEbuffer，均质器拍打混匀，尼龙扎带封口后，室温振荡约20min。

（3）将均质袋滤膜一侧液体倾入50ml离心管，4℃条件下10000×g离心30min。

（4）离心结束后，将上清转移至另一50ml离心管，加入1/4倍体积5×PEG/NaCl溶液，室温条件振荡60min。

（5）振荡完毕，4℃条件下10000×g离心30min。

（6）离心结束，弃上清，继续4℃条件下10000×g离心5min压实沉淀。

（7）向沉淀加入500µlPBS溶液以溶解沉淀。

吸取溶解沉淀后PBS溶液200µl转移至无菌离心管中，作为试样。

剩余溶液分装到离心管中标记作为备样，－80℃冻存。

二、核酸提取

各类样品经前处理后，每个样品分别取200µl，下面表格中提供RNA提取试剂盒供参考，按试剂盒说明书操作提取RNA。

样品种类

试剂盒

粪便或呕吐物

QIAGEN病毒核酸提取试剂盒（QIAamp®viralRNAminikit）或Geneaid病毒核酸提取试剂盒（ViralNucleicAcidExtractionKitII）

水和环境标本

NucliSENSLysisBuffer和NucliSENSMagnetic试剂盒（梅里埃公司）

食品标本

HighPureViralRNAKit（罗氏公司）

三、诺如病毒核酸检测方法

1.方法：

（1）样本类型：

粪便、呕吐物、肛拭子、水、环境涂抹样；

（2）分析方法：

采用诺如病毒双重Real-time（TaqMan®）RT-PCR分析：

（3）使用范围：

ABI7500realtimePCR、Smartcycler（Cepheid）,Mx3005P,Mx3000P（Stratagene）和ICycleriQTMReal-TimePCR检测系统（BioRad）等。

本设计应用QuantiTectMultiplexRT-PCRKits（Qiagen），引物和探针浓度分别被优化为终浓度400nM和200nM。

每个试剂盒特异RT最适环境和活化步骤，需要遵循制造说明书使用。

该试验方法来自美国CDC诺如病毒暴发网络（CaliciNetUSA）双重Real-timeRT-PCR操作标准，引物设计参考文献[59]。

2.设备和材料

涡流混合器、微量离心机、移液器（量程为P20、P200和P1000）、Real-timePCR仪可以是ABI7500（ABI）、Smartcycler（Cepheid）、Mx3005PorMx3000P（Strategene）或BioRadiCycleriQTMReal-TimePCR检测系统（BioRad）。

一次性手套、带滤芯枪头、无菌1.5ml微量离心管、RNA酶去除剂、96-孔反应板、盖子或薄膜。

3.诺如病毒寡核苷酸引物/探针

表1多重荧光定量RT-PCR扩增诺如病毒引物和探针

基因型

引物/

探针

序列（5’-3’）

工作浓度nM）

Cog1F

CGYTGGATGCGITTYCATGA

400

Cog1R

CTTAGACGCCATCATCATTYAC

400

Ring1A

FAM–AGATYGCGATCYCCTGTCCA–BHQa

200

Ring1B

FAM–AGATCGCGGTCTCCTGTCCA–BHQa

200

GII

Cog2F

CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG

400

Cog2R

TCGACGCCATCTTCATTCACA

400

Ring2

JOE–TGGGAGGGCGATCGCAATCT–BHQb

200

注：

aGITaqMan®探针：

5’端用FAM荧光素标记，3’端用BHQ淬灭基团标记；BHQ淬灭基团1更好；bGIITaqMan®探针：

5’端用JOE（HEX或VIC等）荧光素标记，3’端用BHQ淬灭基团标记

4.操作方法

（1）实验准备

用RNA酶去除剂擦拭工作台表面、移液器和离心机除去潜在RNA酶污染。

RealtimePCR仪开机预热15min。

（2）试剂准备

所有试剂冰浴；轻弹管壁混合2×QuantiTectMultiplexRT-PCRMasterMix反应液；

涡旋所有引物和探针5s；

QuantiTectMultiplexRTMix、引物、探针置于冰上。

（3）对照设立

每一次实验都要包括无模板对照（NC）（第一个和最后一个孔各设一个）和阳性对照（PC）（GI和GII诺如病毒核酸或标准品）。

（4）检测

注意：

请在PCR清洁区准备、配制反应体系（mastermix）。

在1.5ml离心管中准备mastermix；

确定每次分析反应数（N），需要多配反应数来弥补重复移液中小量丢失：

♦如果样本数（n）（包括NC和VC对照）=1-14,做n+1个反应mix。

♦如果样本数（n）（包括NC和VC对照）>15,做n+2个反应mix。

配制Real-timeRT-PCR反应混合液22.5µl（表2）

表2诺如病毒双重反应体系配制方案

组成成分

体积（µl）

终浓度（nM）

RNase-freewater

4.25

Cog1F（10μM）

400

Cog1R（10μM）

400

Ring1A（10μM）

0.5

200

Ring1B（10μM）

0.5

200

Cog2F（10μM）

400

Cog2R（10μM）

400

Ring2（10μM）

0.5

200

RNase-freewater

4.25

QuantiTectMultiplexRTMix

0.25

2×QuantiTectMultiplexRT-PCRMasterMix

12.5

1×

吸打混匀MasterMix。

按如下方式排列阴性对照、阳性对照和样品，在每孔中加入22.5µlMasterMix。

（GI）

（GII）

*阴性模板对照（NC）加入第一列，样本加入后面11列，检查加入样本时可能交叉污染。

病毒模板对照（PC在所有样本和NC密封后加入到最后。

加入2.5µlDEPC水到第一个NC孔，盖好。

将反应平板转移到核酸处理区域或清洁区外面。

将RNA样本从－70°C冰箱转移在冰上融化;漩涡振荡5s之后快速离心5s，移液2.5µlRNA样本到标记好孔。

例如,加样本1（S1）到平板位置A2和B2。

如果样本体积小于2.5µl,加DEPC水至反应管使总反应体积达到25µl。

加2.5µl水到最后NC孔，盖好。

最后,移液GI和GII诺如病毒阳性对照各2.5µl到适当PC孔，盖好。

⑪小心混合平板。

⑫4℃离心平板0.02g（500rpm）1min，以移除孔中可能存在气泡和液滴。

⑬RT-PCR扩增条件：

按照ABI7500（orotherplatform）说明书放置好平板。

终反应体积为25µl。

根据QuantiTectMultiplexRT-PCRKits说明书，RT-PCR热循环程序为：

循环数

温度（℃）

时间

20min

15min

45S

5.结果解释

（1）阴性对照（NC）

如果一个或更多NC反应出现假阳性,则可能发生了污染。

这种情况下,检测无效，需重复检测。

（2）阳性对照（PC）

阳性对照产生超过阈值荧光曲线或扩增图像。

（3）检测样本

只有在所有质量控制严格准确时，如果曲线在Ct值为≤40，则认为检测样本为阳性。

四、诺如病毒传统RT-PCR分析

原理：

人诺如病毒分为5个基因组（Genogroup，G），其中GI、GII和GIV型可感染人。

本方案利用衣壳蛋白部分区域（regionC）来对诺如病毒进行分型。

本方案由四个引物组成，扩增ORF25’末端，编码主要外壳蛋白VP1。

引物G1SKF和G1SKR用于GI检测，扩增片段330bp。

引物和CoG2F和G2SKR用于GII监测，扩增片段387bp。

1.设备和材料

涡流混合器、微量离心机、移液器、PCR仪、微波炉、电泳仪和制胶器。

一次性手套、带滤芯枪头、无菌1.5ml微量离心管、RNA酶去除剂、薄壁PCR管（Rnasefree，0.5ml）、LoadingBuffer、QiangenOneStepRT-PCRKit（货号：

210212）

2.诺如病毒寡核苷酸引物/探针（见表3）

表3诺如病毒传统RT-PCR寡核苷酸引物

Region

型别

引物名称

序列（5’-3’）

产物（bp）

G1SKF（+）

CTGCCCGAATTYGTAAATGA

330

G1SKR（+）

CCAACCCARCCATTRTACA

COG2F（+）

CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG

387

G2SKR（-）

CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT

3.操作方法

（1）实验准备

用RNA酶去除剂擦拭工作台表面、移液管和离心机以去掉潜在RNA酶污染。

（2）试剂准备

所有试剂冰浴。

轻弹管壁混合5X缓冲液。

离心酶、RNA酶抑制剂和dNTPs后将其放在冰上备用

涡旋所有引物5s，离心5s备用。

（3）对照设立

每次PCR实验都应设置阴性对照和阳性对照，包括诺如病毒GI和GII，阳性对照为阳性粪便样品。

（4）检测

注意：

在PCR清洁区配置反应体系。

用1.5ml离心管准备反应体系；

确

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