培养条件对大肠杆菌的影响之欧阳化创编.docx

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培养条件对大肠杆菌的影响之欧阳化创编

毕业论文

时间：

2021.02.12

创作人：

欧阳化

题目：

浅析培养条件对大肠杆菌的

生长和rhG-CSF表达的影响

系部：

生物工程系

专业：

生物技术及应用

班级：

生物技术及应用0931班

姓名：

学号：

指导教师：

2012年03月30

山东职业学院

毕业设计（论文）任务书

班级

学生姓名

指导教师

设计（论文）题目

浅析培养条件对大肠杆菌的生长和和rhG-CSF表达的影响

主要

研究

内容

培养条件对大肠杆菌的生长和rhG-CSF表达的影响。

主要从温度，PH值，溶解氧，接种量，培养时间，摇床的转速，工程菌生长时间机诱导时间的对照实验，来研究大肠杆菌的生长和表达的条件。

根据研究的结论，进一步分析大肠杆菌在生物药品生产中的应用最佳条件。

主要技

术指标

或研究

目标

借鉴了大量的著名专家的文献，以文献的知识为主线。

严格每一步的操作。

逐一研究大肠杆菌的生活条件，对照实验结果，得出更严谨的数据。

通过试验得到利于大肠杆菌生长的营养环境和rhG-CSF表达的最佳环境条件，用来提高大肠杆菌工程菌生长和目标蛋白表达，进一步的缩短生产周期，降低生产成本，为大肠杆菌表达的目的蛋白大规模生产奠定最坚实的基础。

基本

要求

严格根据实验步骤合理安排实验,每个实验都设立3个对照,使实验结果更具有说服力，真实可行。

主要参

考资料

及文献

[1]杨炜，王伟刚，田海英，等．重组大肠杆菌高表达高密度发酵研究[J]．生物技术2006

[2]郑大勇，罗荣城．蔡红兵．基因工程抗体anti?

HBsAgFab原核表达体系大规模培养条件的实验研究[J]．第一军医大学学报，2004

[3]霍向东，石玉瑚．大肠杆菌高密度发酵补料调控策略的研究进展[J]．新疆农业科学。

2004

[4]张嗣良．发酵过程多水平问题及其生物反应器装置技术研究,基于过程参数相关的发酵过程优化与放大技术[J]．中国工程科学．2001

1前言-1-

1.1简述-1-

2材料与方法-2-

2.1菌种-2-

2.2试剂-2-

2.3培养基及组成成分添加-2-

2.4培养方法-2-

2.4.1摇瓶发酵-3-

2.4.2种子罐培养-3-

3培养条件对工程菌的生长和rhG-CSF表达的影响-3-

3.1培养温度-3-

3.2pH值-3-

3.3溶解氧-3-

3.4接种量-3-

3.5培养时间-4-

3.6转速-4-

3.7工程菌的生长时间及诱导时机-4-

4OD值的测定-4-

5结果与分析-4-

5.1培养温度的测定-4-

5.2pH值的测定-4-

5.3溶氧量对菌体生长的影响-5-

5.4接种量的影响-5-

5.5培养时间的测定-5-

5.6转速的测定-5-

5.7工程菌的生长曲线及诱导时机对工程菌生长和rhG-CSF表达的影响-5-

6小结与讨论-5-

参考文献-7-

谢辞-8-

摘要

利用大肠杆菌生产药品是一种生物方法：

即利用生物工程技术将外源基因转入大肠杆菌中，经过发酵培养使之表达，经过离心收集菌体，再用特定的溶液使菌体破碎后收集目的蛋白，在经过后续的一些处理制成药品。

从菌种选择方面进行研究。

工业生产用的菌株是在生物工程技术不断筛选后被挑选出的菌株。

选取表达量最高的克隆菌作为发酵用菌种，基因工程菌为大肠杆菌DH5α/pBV220。

为了提高大肠杆菌工程菌生长和目标蛋白表达，缩短生产周期，降低生产成本，进行了单因子试验。

试验分别从培养温度、pH值、溶解氧、接种量、培养时间、转数、诱导时机等方面对rhG-CSF表达的影响进行了逐一研究。

通过试验我们得到了大肠杆菌在10L发酵罐培养的最佳营养条件和最佳环境条件。

通过试验得出的结果培养大肠杆菌，在不同时间段测其OD600nm值，得出最佳诱导时机。

利用得到的结果，结合药品GMP原则，从而得到了大肠杆菌工业化生产工艺，为大肠杆菌表达的目的蛋白大规模生产奠定基础。

关键词：

大肠杆菌；发酵；目的蛋白

1前言

1.1简述

大肠杆菌（Escherichiacoli，E.coli）为革兰氏阴性短杆菌，又称肠埃希氏菌。

大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，周身鞭毛，能运动，无芽孢。

主要生活在大肠内。

培养基中加入伊红美蓝遇大肠杆菌，菌落呈深紫色，并有金属光泽，可鉴别大肠杆菌是否存在。

在不致病的情况下（正常状况下），可认为是互利共生（一般高中阶段认为是这种关系）；在致病的情况下，可认为是寄生。

它的基因组DNA为拟核中的一个环状分子。

同时可以有多个环状质粒DNA。

大肠杆菌是研究微生物遗传的重要材料。

大肠杆菌是细菌，属于原核生物；具有由肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，没有细胞核有拟核；大肠杆菌的代谢类型是异养兼性厌氧型。

大肠杆菌细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。

作为外源基因表达的宿主，大肠杆菌遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，繁殖迅速，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。

目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系，是生物学上重要的实验材料。

1.2重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）

重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF），是应用基因重组工程技术制成的一种蛋白质，作为粒系祖细胞及成熟中性粒细胞表面的特异性受体结合，促进前者的增殖分化并增强后者的功能（包括趋化性、吞噬和杀伤功能等）。

本蛋白还可促进髓系造血祖细胞的增殖、分化和成熟，调节中性粒细胞系的增殖与分化成熟；也可驱使中性粒细胞释放至血流，使外周中性粒细胞数量增多。

rhG-CSF为Ⅱ类造血刺激因子，有细胞系特异性，仅作用于中性粒细胞及其祖细胞。

适用治疗各种原因引起的中性粒细胞减少症，较大剂量也可用于骨髓增生异常综合征，与再生障碍性贫血伴发的中性粒细胞减少症。

2材料与方法

2.1菌种

处于安全考虑，工业生产用的菌株是在生物工程技术不断筛选后被挑选出的菌株。

这些菌株失去了细胞壁的重要组分，在自然条件下已无法生长。

甚至普通的清洁剂都可以轻易地杀灭这类菌株。

这样，即便由于操作不慎导致活菌从实验室流出，也不易导致生化危机。

发酵用菌种的筛选:

用LB液体培养基铺平皿,接种,30℃培养18h,挑单菌落接种于含5mlLB培养基（50μg/ml氨卞西林钠）的试管中,30℃培养至OD600nm为0.4-0.6,升温至42℃,培养3h,离心收集菌体,SDS-PAGE检测,选取表达量最高的克隆菌作为发酵用菌种。

基因工程菌为大肠杆菌DH5α/pBV220。

2.2试剂

氯化钠、氢氧化钠、工业消泡剂、甘油、硫酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、无水硫酸镁、酵母粉和蛋白胨、琼脂等。

2.3培养基及组成成分添加

发酵大肠杆菌所需培养基包括种子罐培养基,发酵罐培养基（以种子培养基为基质,再添加适量营养成分、无机盐和微量元素）。

微生物生命活动过程中需要的化合物有碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。

在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。

每1L配制好的微量元素溶液中含有FeCl3·6H2O3.24g,ZnCl20.22g,CoCl2·6H2O0.24g,NaMoO4·2H2O0.24g,CaCl2·2H2O0.12g,CuSO4·5H2O0.20g,H3BO31.00g,MgSO40.74g及62mLw=38%的盐酸溶液。

取130μL上述微量元素溶液及4μL25g/L的维生素溶液,将其一起加入到100mL的培养基中。

2.4培养方法

我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌。

准确称取各成分。

配置LB固体培养基时还需要加入琼脂。

在250ml三角瓶和500ml

三角瓶中分别装入30ml和230mlLB液体培养基。

将三角瓶用6层纱布包住瓶口，再用牛皮纸包好，放入灭菌柜内，121℃液体程序灭菌20min。

2.4.1摇瓶发酵

将在-70℃的甘油管中冻存的基因工程菌（大肠杆菌）菌种接种于装有LB液体培养基的250ml三角瓶中,所有培养基均含氨苄西林钠（Amp）0.1g/mL。

将培养液在37.5℃,200r/min的摇床条件下培养17-18小时,取出，放于洁净密闭工作台中。

手消毒后点燃酒精灯，于工作台中吸取2mL菌液，再接种于装有230mlLB液体培养基的500mL三角瓶中。

将培养液放入摇床中培养，培养至菌体光密度达到所需要求后,将其作为一级种子。

2.4.2种子罐培养

将一级种子接种于10L种子罐培养基（含Amp0.1g/mL）中，通气量为50L/min,搅拌速度为200-1000r/min,当培养至菌体光密度达到所需要求时,升温至42℃,诱导表达一定时间。

发酵中加入一定比例的工业消泡剂消除泡沫，以防泡沫过多，影响发酵。

在接种前取样一次,并将此样品作为比色测定的参比溶液。

接种后每隔30min取样一次,测菌体光密度,最后取2mL发酵终止液进行离心,测定菌体光密度、菌体湿重、菌体干重和rhG-CSF的表达量。

3培养条件对工程菌的生长和rhG-CSF表达的影响

3.1培养温度

在LB液体培养基中，按4％的接种量，30～40℃，200r／min，溶氧量50％，在pH7.5的培养基中培养18h，取菌液测定菌体密度。

每个处理设3个重复。

3.2pH值

以35mol／L的Na2HPO4-NaH2PO4为缓冲液，将培养基分别调至pH6.0～8.5，4％的接种量，37.5℃，200r／min，溶氧量50％，培养18h后测定菌体密度。

每个处理设3个重复。

3.3溶解氧

按照4％接种量接人液体大肠杆菌种子液，37.5℃，200r／min，在pH7.5的培养基中培养，并以不同的通气量，使溶氧指数达到20％、30％、40％、50％、60％、70%，18h后取菌液测定菌体密度。

每个处理设3个重复。

3.4接种量

按照不同的接种量1％、2％、3％、4％、5％，接种于10L发酵罐中，在37.5℃，200r／min，溶氧量50％，pH7.5的培养基中培养，18h取菌液测定菌体密度。

每个处理设3个重复。

3.5培养时间

按4％接种量接入含LB培养基的10L发酵罐中，37.5℃，在培养过程中自动控制pH7.5，溶氧量50％，200r／min，培养10h后每隔2h测定菌体密度。

每个处理设3个重复。

3.6转速

按4％接种量接入含LB培养基的10L发酵罐中，在100～300r／min，自动控制pH7.5，溶氧量50％，pH7.5的培养基中培养，37.5℃培养18h后测定菌体密度。

每个处理设3个重复。

3.7工程菌的生长时间及诱导时机

在选定的发酵罐培养条件下,将种子液接种于发酵培养基中,测定工程菌在37.5℃时的生长曲线，观察工程菌生长和rhG-CSF的表达。

实验同时还比较不同的诱导时机对工程菌生长和rhG-CSF表达的影响。

4OD值的测定

在10L发酵罐中的应用验证取冻存菌株，经二次划平板活化后接种于LB液体培养基中，摇床过夜培养（200r／min，37.5℃）成一级种子。

取一级种子液，以4％的接种量再次转接种于LB液体培养基中，200r／min，37.5℃培养15h成二级种子。

将发酵基础培养基加人发酵罐，灭菌后以工作体积的4％接种二级种子，然后按照以上优化的基本反应条件进行发酵培养。

分别在发酵后6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h取发酵液，于分光光度计下测OD600的值，得出菌体密度。

5结果与分析

5.1培养温度的测定

培养温度优化在35～40℃范围内菌体密度随温度的升高而升高，这符合大肠杆菌的生长特性。

但在37～38℃时增长速度较快，随后的增长比较平缓。

结合大肠杆菌的一般培养特性和温度与其他影响因素间的交叉影响，本试验中设定培养温度为37.5℃。

5.2pH值的测定

pH值优化利用不同pH值的培养基对大肠杆菌培养18h后，结果显示。

pH值在8.0时对菌体密度没有很大影响，而pH值过低或过高均达不到良好的效果。

pH值在7.5时所得到的菌体密度相对最高，其OD600nm达到3.25。

5.3溶氧量对菌体生长的影响

溶氧量的优化根据发酵罐中不同的溶氧指数，得到培养18h时发酵体系的菌体密度。

结果表明，菌体密度随着在溶氧指数的增加而不断增加，但在50％以后菌体密度增加缓慢。

5.4接种量的影响

接种量的优化不同的接种量可以对细菌的生长产生较大影响，3％～4％时，细菌的生长状态优于过低或高的接种量，过低的接种量会使菌体生长过慢而过高的接种量会使营养物质早期大量消耗，并且会造成种子菌株的浪费。

所以本试验中采用4％的接种量。

5.5培养时间的测定

优化不同培养时间的结果显示，12～18h细菌呈倍数增长，之后的增长缓慢。

表明指数生长后期，细菌的能量已不适于大量繁殖，而是受代谢产物的影响。

因此，为了缩短生长周期，细菌的收获应在指数生长后期，即18h为宜。

5.6转速的测定

摇床转速优化随着溶氧量增大菌体密度相应提高。

在100～200r／min时菌体密度增长速度较快，200～300r／min时增长相对缓慢，说明200r／min的转速已经可以促进空气中氧的溶解。

考虑到转速的增加可能会产生泡沫等不利影响，所以，本试验中所采取的最佳转速为200r／min。

5.7工程菌的生长曲线及诱导时机对工程菌生长和rhG-CSF表达的影响

在选定的发酵罐培养条件下,将种子液接种于发酵培养基中,测定的工程菌在37.5℃时的生长曲线如图1所示。

由图1知,接种后菌体数量并不是立即增长，而是经历了1h左右的延迟期，这可能是由于菌体为适应新的环境，诱导出了新的代谢途径。

之后菌体迅速进入对数生长期，生长大约18h后菌体光密度OD600nm最高可达22.0。

在对数生长末期，营养物质大多已被消耗，并且积累了抑制菌体生长的代谢产物，培养体系图1工程菌间歇培养的生长曲线

中菌体数目的增长逐渐停滞，生长进入稳定期和衰亡期。

实验同时还比较了不同的诱导时机对工程菌生长和rhG-CSF表达的影响（表2）.

表2　诱导时机对工程菌生长和rhG-CSF表达的影响

诱导时机

D600

菌体光密度

D600

菌体干重

/（g•L-1）

rhG-CSF表

达量/%

1.04

4.76

3.09

23.5

2.07

7.77

5.57

27.9

2.52

8.46

5.58

29.3

3.12

10.92

6.25

30.4

3.48

10.92

6.15

35.9

4.41

11.34

6.71

37.7

5.06

12.39

6.89

30.9

综合考虑菌体生物量和rhG-CSF的表达量，为使rhG-CSF的产量最高，应选择在菌体光密度OD600nm≈4.5时对菌体进行诱导，此时可得到较高的菌体干重，同时rhG-CSF的表达量也较高。

6小结与讨论

通过试验我们得到了大肠杆菌在10L发酵罐培养的最佳营养条件和最佳环境条件。

从工业要求的角度，同时在遵循药品生产质量管理规范（GMP）原则、有效利用现有的设备达到预期生产规模的前提下，将在10L发酵罐中获得的最佳发酵条件，应用于200L发酵罐进行生产试验。

结果显示，大肠杆菌DH5α/pBV220经高密度发酵后的菌体浓度可以达到12.94g／L，这不仅为其规模化生产奠定了基础，也在GMP原则的指导下探索到了一套标准化的生产工艺，使大肠杆菌的发酵更简便、快捷、操作性更强，并具备进一步工业化研究的潜力。

在试验中得到培养20h时细菌的密度依然呈上升趋势，并明显高于18h时，然而由于随着培养时间的延长，细菌会不断地衰老死亡，活菌比例不断减少，导致所得产物的免疫原性受到一定的影响。

所以认为，在进行大肠杆菌高密度发酵时，控制培养时间在18h是比较合适的。

溶解氧是影响细菌发酵的重要因素之一。

溶氧指数是指测得水体的溶氧量与监测水体有相同水温和盐度时的饱和溶氧量之比。

本试验采取连续流加，即补料前通过转速和通气量将溶氧控制点设定在50％。

发酵后开始补料并通过控制补料、转速和通气量将溶解氧维持在50％。

结果显示，将压缩空气的通气流量控制在5m／h，可以维持发酵系统50％的溶氧指数。

另外，细菌快速生长期补加10％～20％的水，可以改变发酵液流变学性质，增加氧的传递、提高摄氧率，从而利于发酵进行。

利用搅拌的方法可以有效加速氧的溶解，控制适宜的pH和培养基的溶氧指数。

但过高的转速会产生大量的泡沫，反而会导致溶氧浓度的降低。

参考文献

[1]柴家前．陆庆泉．沈志强等．大肠杆菌高密度发酵研究进展[J]．中国预防兽医学报,2000.

[2]刘文波，柴同杰．大肠杆菌高密度发酵研究[J]动物科学与动物医学,2001

[3]李民，修朝阳,陈常庆生脯氨酰内肽酶培养条件的优化及高密度发酵[J]．生物工程学报，2000.

[4]杨炜．王伟刚,田海英,等．重组大肠杆菌高表达高密度发酵研究[J]．生物技术2006.

[5]刘社际,葛永红,杨立明．培养温度对基因工程菌生长密度和rhG-CSF表达的影响[J]．中国生物制品学杂志,1999.

[6]郑大勇，罗荣城．蔡红兵．基因工程抗体anti-HBsAgFab原核表达体系大规模培养条件的实验研究[J]．第一军医大学学报,2004.

[7]霍向东,石玉瑚．大肠杆菌高密度发酵补料调控策略的研究进展[J]．新疆农业科学,2004.

[8]张嗣良．发酵过程多水平问题及其生物反应器装置技术研究,基于过程参数相关的发酵过程优化与放大技术[J]．中国工程科学,2001.

谢辞

这篇论文是在我的导师张老师的多次精心指导和大力支持下完成的。

从论文的选题到结构安排，从内容到文字润饰，都凝聚了她大量心血。

在这篇论文的写作过程中，张小茜老师不辞劳苦，多次与我就论文中许多核心问题做深入细致的探讨，给我提出切实可行的指导性建议，并细心全面地修改了我的论文。

张老师使我深受感动。

严谨求实的治学态度、高度的敬业精神、兢兢业业、孜孜以求的工作作风和大胆创新的进取精神，使我深受感动。

她渊博的知识、开阔的视野和敏锐的思维给了我深深的启迪。

同时，在此次毕业设计过程中我也学到了许多了关于微生物发酵方面的知识，实验技能有了很大的提高。

最后，再次对关心、帮助我的老师表示衷心地感谢。

其次，还要感谢大学三年间给我诸多教诲和帮助的各位老师，感谢他们的辛勤栽培。

在他们的帮助和支持下，我能够很好地掌握和运用专业知识并在实际中得以应用。

我还要感谢我的各位同学以及校外的实习老师，在毕业设计及论文的写作过程中，你们给了我很多的启发和帮助，提出了很多宝贵的意见，直到顺利完成毕业论文，在此我表示深深的感

时间：

2021.02.12

创作人：

欧阳化