细菌及细胞电镜观察样品制备方法_精品文档.doc

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细菌样品冷冻干燥制样方法

1）取样：

取大量样品离心（转速3000r~4000r），去除上清液，加入适当PH（7.2~7.4）的0.1MPBS清洗三遍；清洗时菌体温柔悬浮。

2）固定：

2.5%戊二醛固定3h（此步时间非绝对，1~12h都可），用PBS清洗两遍，每遍10min。

再用纯水清洗两遍。

3）梯度脱水：

用乙醇的水溶液按30%、50%、70%、80%、90%的浓度梯度对样品进行脱水，每步15min，之后在100%乙醇的水溶液中脱水15min×2次；再将样品置于乙醇和叔丁醇1:

1混合液中15min；最后置样品于叔丁醇中15min×2次。

（此步也可以尝试不做）

4）冷冻干燥：

滴加处理好的样品于5*5mm的盖玻片上，置-80度冰箱冷冻后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥。

5）电镜观察：

样品充分干燥后，进行扫描电镜观察。

2.5%戊二醛：

Step1:

0.2M磷酸缓冲液的配制：

（0.1M的就是稀释2倍）取50mL定容100mL

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磷酸二氢钠（NaH2PO4.H2O）　　　　2.6克

磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）　　　　29克

双蒸馏水　　　　　　　　　　加至500毫升

pH调至7.4

Step2:

戊二醛固定液的配制：

---------------------

25%戊二醛　　　　　　1ml

双蒸馏水　　　　　　　4ml

0.2mol/L磷酸缓冲液　　5ml

戊二醛最终浓度　　　　2.5%

pH值7.3-7.4